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研究目的:体外设计并合成靶向于人ARID1A基因的siRNA,转染人卵巢透明细胞癌ES2细胞,筛选出下调ARID1A表达的有效片段,研究ARID1A基因沉默对顺铂敏感性的影响,探讨可能涉及的分子通路改变;研究蛋白激酶B抑制剂哌立福辛联合顺铂对ES2细胞的体外增殖抑制作用,探讨二者联合的协同作用及可能的促凋亡机制,为今后卵巢透明细胞癌的分子靶向治疗提供一定的理论依据。研究方法:体外合成各组siRNA并瞬时转染ES2细胞;利用RT-PCR法和western blot法分别从mRNA和蛋白水平检测ARID1A基因沉默情况,筛选出最佳片段(即siRNA-3)。使用siRNA-3片段瞬时转染ES2细胞,24 h后加入不同浓度的顺铂,孵育48 h后采用CCK-8法检测各实验组半数抑制浓度(IC50);转染后24h加入相同浓度的顺铂50 μM,孵育48 h后测得各组细胞生存率;采用流式细胞仪检测各实验组ES2细胞的凋亡率:采用western blot法检测各实验组ES2细胞中蛋白激酶B(AKT)表达水平的变化。以不同浓度哌立福辛作用于ES2细胞48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;以哌立福辛最小有作用剂量与不同浓度顺铂联合处理细胞48 h,以金氏公式筛选出协同抑制作用最明显的联合剂量,以该联合剂量处理ES2细胞48 h,采用DAPI染色法及流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;采用Giemsa染色法检测细胞有丝分裂指数;采用western blot法检测细胞中Caspase-3(cleaved)及PARP(cleaved)蛋白表达水平的变化。研究结果:使用ARID1A特异性siRNA-3片段转染ES2细胞后,CCK-8法结果显示:siRNA-3组的IC50较siRNA-NC组和空白对照组均升高(均P<0.05);加入相同浓度的顺铂, siRNA-3组细胞生存率明显高于siRNA-NC组和空白对照组(均P<0.05)。流式结果显示:siRNA-3联合顺铂组细胞凋亡率明显低于顺铂组(P<0.01),siRNA-3组细胞凋亡率低于对照组(P<0.05);western blot结果显示:siRNA-3组中AKT蛋白表达水平较对照组升高(P<0.01),顺铂组中AKT蛋白表达水平较对照组降低(P<0.01),siRNA-3联合顺铂组中AKT蛋白表达水平较顺铂组升高(P<0.05)。CCK-8法检测显示:哌立福辛在48 h对ES2细胞的最小有作用剂量为4μM,以金氏公式计算结果提示4 μM哌立福辛+40μM顺铂联合用药协同抑制细胞增殖作用最强;与哌立福辛或顺铂单独作用组相比,DAPI染色发现联合用药组镜下可见大量的细胞核碎裂;联合用药能够协同增加细胞凋亡率;协同抑制细胞有丝分裂;联合用药能够明显增加细胞中Caspase-3 (cleaved)蛋白的表达,降低PARP(cleaved)蛋白的表达(P<0.01)。研究结论:采用siRNA干扰片段沉默卵巢透明细胞癌ES2细胞中ARID1A基因表达后能够降低ES2细胞对顺铂的敏感性,减少细胞的凋亡;推测其机制可能涉及蛋白激酶B(AKT)信号通路的激活。AKT抑制剂哌立福辛联合顺铂能够协同抑制卵巢透明细胞癌ES2细胞的增殖并诱导肿瘤细胞发生凋亡:其促凋亡机制可能是通过上调Caspase-3 (cleaved)及下调PARP(cleaved)蛋白的表达实现的。