阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),是一种常见的神经系统退行性疾病,以进行性记忆力减退、认识功能障碍、执行能力障碍、失语、失用、视空间障碍以及精神行为异常为主要临床特征。随着世界人口老龄化程度的不断加剧,AD的发病率逐年升高,在老年人群中AD已成为继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第4位致死原因,给社会和家庭带来了沉重的负担。AD的发病机制复杂,至今尚未明确,目前存在的假说包括β淀粉样蛋白毒性学说、Tau蛋白代谢异常学说、基因突变学说、胆碱能缺乏学说、兴奋性氨基酸毒性学说、神经炎症学说、钙超载学说、代谢综合征学说等。因其发病机制复杂,AD仍缺乏有效的治疗手段。目前经FDA批准用于治疗AD的药物只有多奈哌齐和美金刚,然而这两种药物只能改变神经递质水平,不能改变AD的病理过程、阻止AD的病情进展,因此对AD的治疗仍是世界范围内医学研究者所面临的挑战之一。研究证实AD患者脑内小胶质细胞在Aβ刺激下激活,被长期、慢性活化,进而合成和释放大量炎症介质,最终造成神经元的损伤和丢失。存在于小胶质细胞中的NF-κB作为多效性的核转录因子,能够调控多种炎症因子的信号转导,其中一条重要的炎症信号通路就是NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β。NF-κB被激活后转移到细胞核内,一方面诱导IL-1β基因表达,产生大量无活性的IL-1β前体(pro-IL-1β),另一方面诱导NLRP3表达。NLRP3在外界损伤刺激下,募集接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1组成NLRP3炎症体,后者会将pro-IL-1β剪切为有强烈促炎活性的IL-1β,进而诱导其他炎症因子、趋化因子等的合成,导致脑内的炎症级联反应。目前已有多项研究证实,抑制NLRP3炎症体可以减少Aβ的沉积,改善认知功能。因此,NLRP3炎症小体成为了目前AD防治研究领域的热点。临床流行病研究究显示,长期服用非甾体抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)的患者AD的发病率明显减低。这一现象提示我们:以调控神经炎症为靶点来治疗AD,可能会获得良好的治疗效果。然而,目前已开展的针对NSAIDs治疗AD的数项临床试验大多因药物的胃肠道副作用而中止,从而限制了抗炎疗法在AD治疗领域中的探索性研究。中医药是中华民族的伟大瑰宝之一,以其低毒、调节全身机体功能的整体观,以及多靶点、多环节的作用特点,在众多疾病的防治中起到了良好的效果。基于对痴呆的中医病机的理解和阅读经典中医古籍,结合前期的研究成果,我们在古代经方“不忘散”基础上,根据单味中药之间的有机配伍和协同作用,构建了由远志、石菖蒲、人参、茯苓、茯神、当归、白术和黄连组成的“加味不忘散”。该组方更加合理全面,既扶正又祛邪,切中、兼顾了 AD的主要病机。目前已应用于临床,收到了较好的效果。在前期研究基础上,本研究以神经免疫炎症学说为根据,以信号转导通路途径为切入点,从体内实验和体外实验两个层次,验证加味不忘散治疗AD的有效性,并进一步观察该组方对AD神经炎症的影响。第一部分加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆功能及海马组织结构的影响目的:1.观察加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆功能影响;2.观察加味不忘散对AD模型大鼠海马组织结构和神经元凋亡的影响。方法:1.将SD大鼠分为假手术组、AD模型组、加味不忘散低剂量干预组、加味不忘散中剂量干预组、加味不忘散高剂量干预组和MCC950干预组;2.通过脑立体定位技术向双侧海马注射Aβ1-42制备AD大鼠模型;3.运用Morris 水迷宫试验评估大鼠学习记忆功能;4.大脑切片进行HE染色,在光镜下观察大鼠海马的组织结构;5.利用透射电镜观察海马超微结构变化,并计数突触数量进行比较;6.运用TUNEL染色法观察海马神经元凋亡情况。结果:1.加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆试验的影响:假手术组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为 69.79±13.54 s、52.16±3.87 s、34.75±17.10 s、19.71±5.39 s、10.57±3.85 s。AD模型组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为79.21±16.37s、74.46±5.58s、65.00±8.62s、41.82±8.87s、28.96±6.73s,与假手术组相比,在第 2-5 天的逃避潜伏期均明显延长(P<0.01)。加味不忘散低剂量干预组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为 77.96±13.83 s、75.78±7.92 s、62.91±7.99 s、38.82±10.93 s、25.75±6.77 s,与AD模型组相比无显著差异(p>0.05)。加味不忘散中剂量干预组大鼠第1天到第 5 天的逃避潜伏期分别为 76.21±12.80s、64.28±8.37s、50.87±8.61s、30.82±5.33s、19.82±2.68 s,第2-5天的逃避潜伏期较AD模型组和加味不忘散低剂量干预组明显缩短(p<0.05)。加味不忘散高剂量干预组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为70.42±14.08s、54.74±10.40s、38.07±8.31s、22.59±5.42s、14.39±3.51s,第 2-5 天的逃避潜伏期较AD模型组和加味不忘散低剂量干预组明显缩短(p<0.01),较加味不忘散中剂量干预组也缩短(P<0.01)。MCC950干预组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为 71.65±16.03s、54.51±10.01s、39.36±7.14s、22.24±5.11s、13.93±3.68s,第 2-5天的逃避潜伏期较AD模型组和加味不忘散低剂量干预组明显缩短(p<0.01),较加味不忘散中剂量干预组也缩短(P<0.01),与加味不忘散高剂量干预组相比无显著差异(P值分别为 0.938、0.815、0.928、0.857)。2.加味不忘散对AD模型大鼠空间探索能力的影响:假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠的原平台象限停留时间分别为41.14±4.22s、23.28±8.34s、24.57±7.33s、31.71±6.97s、39.43±5.44s、39.15±4.06s。其中AD模型组大鼠的原平台象限停留时间明显短于假手术组(p<0.001),加味不忘散低剂量干预组大鼠的原平台象限停留时间也明显短于假手术组(P<0.001),与AD模型组无明显差异(p=0.703)。加味不忘散中剂量组大鼠的原平台象限停留时间较AD模型组(P = 0.016)和加味不忘散低剂量干预组(p = 0.040)均有所延长。加味不忘散高剂量组大鼠的原平台象限停留时间较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p = 0.027)均延长。MCC950干预组大鼠的原平台象限停留时间较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p = 0.033)均延长,与加味不忘散高剂量组相比无统计学差异(p= 0.933)。假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠的跨台次数分别为 12.71±2.63、5.29±1.38、7.43±1.62、9.71±1.50、12.14±2.41、12.29±3.39。其中AD模型组大鼠的跨台次数明显少于假手术组(p<0.001),加味不忘散低剂量干预组大鼠的跨台次数也明显少于假手术组(p<0.001),与AD模型组无明显差异(p = 0.056)。加味不忘散中剂量组大鼠的跨台次数较AD模型组(p<0.001)和加味不忘散低剂量干预组(p = 0.042)均增多。加味不忘散高剂量组大鼠的跨台次数较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p=0.031)均增多。MCC950干预组大鼠的跨台次数较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p = 0.023)均显著增多,与加味不忘散高剂量组相比无统计学差异(p = 0.895)。3.加味不忘散对AD模型大鼠海马组织结构的影响:HE染色显示,AD模型组和加味不忘散低剂量组海马神经元数量明显减少,细胞体积缩小,核固缩,排列紊乱;加味不忘散中、高剂量干预组和MCC950大鼠海马神经元数量明显增多、排列变整齐、异常细胞减少。4.加味不忘散对AD模型大鼠海马超微结构的影响:通过透射电镜观察到,AD模型组大鼠海马大量神经元变性、坏死,核固缩,线粒体肿胀明显。与AD模型组相比,随着加味不忘散干预剂量的增加,大鼠海马神经元形态逐渐变完整,变性或坏死的神经元逐渐减少,细胞浆内细胞器数量逐渐增多、形态逐渐转为正常。5.加味不忘散对AD模型大鼠海马突触结构和数量的影响:通过透射电镜观察海马突触结构发现,AD模型组大鼠海马内的突触结构被破坏,突触结构不完整,突触间隙增大,突触后膜内的致密物质变薄。与AD模型组相比,随着加味不忘散干预剂量的增加,海马内突触结构逐渐由不完整变完整,突触间隙由大变小,突触后膜内的致密物也由少变多。假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠海马的突触数量分别为 27.31±6.99、10.76±3.19、13.64±3.53、19.61±3.69、25.77±7.21、24.93±5.97。其中AD模型组大鼠海马的突触数量较假手术组明显减少(p<0.001),加味不忘散低剂量干预组大鼠海马的突触数量也明显少于假手术组(P<0.001),与AD模型组无明显差异(p = 0.248)。加味不忘散中剂量组大鼠海马的突触数量较AD模型组(p = 0.001)和加味不忘散低剂量干预组(p = 0.015)均增多。加味不忘散高剂量组大鼠海马的突触数量较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p = 0.013)均增多。MCC950干预组大鼠海马的突触数量较AD模型组(P<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(P<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p= 0.031)均显著增多,与加味不忘散高剂量组相比无统计学差异(p = 0.709)。可见,加味不忘散对AD模型大鼠突触结构和数量具有改善作用,并具有剂量依赖性。6.加味不忘散对AD模型大鼠海马神经元凋亡的影响:TUNEL染色显示,假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠海马的细胞凋亡率分别为 5.50±2.13%、38.06±12.87%、31.33±11.57%、22.71±7.55%、16.43±4.25%、14.38±5.28%。AD模型组可见到大量凋亡细胞,与假手术组相比明显增多(p<0.001)。加味不忘散低剂量干预组大鼠海马内也可见到大量凋亡细胞与AD模型组无明显差异(p = 0.623)。加味不忘散中剂量干预组大鼠海马凋亡细胞,较AD模型组明显减少(p<0.001),较加味不忘散低剂量干预组有减少趋势,但无显著性差异(p = 0.058)。加味不忘散高剂量干预组大鼠海马的凋亡细胞明显少于较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和中剂量干预组(p = 0.16)。MCC950干预组大鼠海马的凋亡细胞数较AD模型组明显减少(p<0.001),与加味不忘散高剂量干预组相比无显著差异(P = 0.907)。结论:1.加味不忘散有利于AD模型大鼠学习记忆能力的改善。2.加味不忘散有利于减轻AD模型大鼠海马组织的病理损害。第二部分加味不忘散对AD模型大鼠海马内炎症反应的影响目的:1.观察加味不忘散对AD模型大鼠海马炎症反应的影响。2.观察加味不忘散对AD模型大鼠海马NF-κB-NLPR3炎症体-caspase-1-IL-1β炎症通路的影响。方法:1.应用ELISA技术检测大鼠血清和海马内炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。2.应用 qRT-PCR 技术检测海马内 NF-κB、NLPR3、caspase-1 和 IL-1βmRNA 的水平。3.应用免疫组化技术和western blot技术检测海马细胞内NF-κB、NLPR3、caspase-1和IL-1β的蛋白水平。结果:1.加味不忘散对AD模型大鼠脑内炎症反应的影响:通过ELISA检测显示,假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α比较均未见显著性差异,p值分别为0.286、0.414和0.394。假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠海马中的 IL-1β 分别为 27.88±4.64 pg/mL、48.75±3.01 pg/mL、45.63±3.29 pg/mL、42.13±4.50pg/mL、38.88±4.02pg/mL、34.88±1.25;海马中 IL-6 水平分别为 29.38±8.07 pg/mL、57.12±6.08pg/mL、53.50±7.73pg/mL、47.13±5.06pg/mL、40.25±4.46pg/mL、39.25±3.92pg/mL;海马中 TNF-α 的水平分别为 32.63±3.62pg/mL、57.88±6.56pg/mL、54.25±4.06pg/mL、49.88±3.80pg/mL、43.00±7.27pg/mL、46.63±6.14pg/mL。统计学分析显示,加味不忘散中剂量和高剂量干预组大鼠海马内的IL-1β、IL-6和TNF-α均明显低于AD模型组(p<0.05)。而各组大鼠海马内IL-1β、IL-6和TNF-α的水平随着加味不忘散剂量的增高而呈下降趋势。2.加味不忘散对NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β炎症通路的影响:qRT-PCT、westernblot和免疫组化检测结果显示,在AD模型组,NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β 炎症通路被激活,NF-κB、NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 的转录和表达水平较假手术组明显增高(p<0.01)。加味不忘散低剂量组大鼠海马内NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的转录和表达水平较AD模型组无明显差异(p>0.05)。高剂量的加味不忘散可以明显抑制NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β炎症通路,与AD模型组相比NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的转录和表达水平均明显下降(p<0.01)。而在加味不忘散低、中、高剂量三组之间,随着药物干预剂量的增高,NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的转录和表达水平逐渐下降。结论:加味不忘散可抑制AD大鼠模型脑内的NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β炎症通路,有利于降低神经炎症及神经元凋亡水平。第三部分加味不忘散对BV-2细胞炎症反应的抑制作用以及对NF-KB-NLRP3 炎症体-caspase-1-IL-1β通路的影响目的:1.观察加味不忘散对Aβ1-42诱导的BV-2细胞炎症反应的影响;2.观察加味不忘散对BV-2细胞内NF-κB-NLPR3炎症体-caspase-1-IL-1β炎症通路的影响。方法:1.将BV-2细胞分为正常对照组、Aβ处理组、加味不忘散低剂量干预组、加味不忘散中剂量干预组、加味不忘散高剂量干预组和MCC950干预组;2.运用Aβ1-42刺激BV-2细胞,在体外条件下模拟AD的小胶质细胞激活过程;3.制备加味不忘散大鼠含药血清,根据不同分组进行细胞培养;4.应用ELISA技术检测细胞培养液中炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;5.应用Transwell共培养技术,将BV-2细胞与SH-SY5Y细胞共培养,通过流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡情况;6.运用 westernblot 检测 BV-2 细胞内 NF-κB、NLPR3、caspase-1 和 IL-1β 的蛋白水平;7.应用免疫荧光技术观察BV-2细胞内NF-κB和NLRP3炎症体的活化情况,以及IL-1β的释放情况。结果:1.加味不忘散对BV-2细胞活化的影响:通过免疫荧光观察BV-2细胞的形态,Aβ处理组BV-2细胞被激活,细胞圆大,分支减少,聚集成簇,而使用加味不忘散含药血清培养BV-2细胞,随着药物剂量的增加,BV-2细胞胞体逐渐由大变小,分支增多,聚集成簇现象减少。2.加味不忘散对BV-2细胞炎症介质的影响:通过ELISA检测显示,正常对照组、Aβ处理组、加味不忘散低剂量干预组、加味不忘散中剂量干预组、加味不忘散高剂量干预组和MCC950干预组BV-2细胞培养液中IL-1β的水平分别为21.74±7.23 pg/mL、58.54±6.84pg/mL、51.58±4.35pg/mL、41.41±4.43pg/mL、33.67±6.70pg/mL、32.63±4.44pg/mL;IL-6 的水平分别为 20.26±4.29pg/mL、47.04±6.99pg/mL、41.67±4.09 pg/mL、33.27±4.74pg/mL、27.41±4.12pg/mL、29.40±6.95pg/mL;TNF-α 的水平分别为35.11±10.26pg/mL、89.26±11.88pg/mL、81.49±5.37pg/mL、70.09±12.01pg/mL、53.57±8.35pg/mL、54.37±9.55pg/mL。统计学分析显示,Aβ处理组BV-2细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平最高,明显高于正常对照组(p<0.001)。加味不忘散中、高剂量干预组BV-2细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均明显低于Aβ处理组(p<0.05),而且随着加味不忘散干预剂量的增加,IL-1β、IL-6和TNF-α的水平呈逐渐下降趋势。3.加味不忘散对神经元细胞的保护作用:应用流式细胞术检测Transwell共培养体系中SH-SY5Y细胞的凋亡率显示,正常对照组、Aβ处理组、加味不忘散低剂量干预组、加味不忘散中剂量干预组、加味不忘散高剂量干预组和MCC950干预组中SH-SY5Y 细胞的总凋亡率分别为 5.42±0.76%、27.37±2.23%、24.79±5.65%、18.14±4.54%、11.41±3.58%和10.86±2.81%。Aβ处理组SH-SY5Y细胞的凋亡率明显高于正常对照组(p<0.001),与加味不忘散低剂量干预组相比无明显差异(p = 0.989)。在加味不忘散中剂量和高剂量干预组,SH-SY5Y细胞的细胞总凋亡率均明显低于Aβ处理组(p<0.001)。加味不忘散低、中、高剂量干预组SH-SY5Y细胞的细胞总凋亡率相比,随着药物浓度的升高,细胞总凋亡率逐渐下降。4.加味不忘散对BV-2细胞内NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β炎症通路的影响:western blot发现,与正常对照组相比,Aβ处理组BV-2细胞内NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白水平明显增高(p<0.001)。与Aβ处理组相比,加味不忘散低剂量干预组内NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的水平未见明显降低(p>0.05)。加味不忘散中、高剂量干预组BV-2细胞内NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β水平较Aβ处理组明显下降(p<0.01),且具有剂量依赖性。通过免疫荧光观察显示,Aβ处理组BV-2细胞内可见到大量活化的NF-κB和NLRP3炎症体,释放大量IL-1β;而在使用加味不忘散干预后,随着药物剂量的增加,活化的NF-κB和NLRP3炎症体逐渐减少,IL-1β的释放也逐渐减少。结论:加味不忘散可以以小胶质细胞为靶点,抑制小胶质细胞内NF-κB和NLRP3炎症体的活化,减少IL-1β的释放,进而抑制小胶质细胞所介导的神经炎症反应,有助于神经元的保护。