目的:炎症性肠道疾病（Inflammatory bowel disease）是一组累及到胃肠道的慢性炎症疾病,其主要临床表现为腹泻、腹痛、粘液血便等,对人们的生活质量造成了极大的影响。现在是美国最常见的五大胃肠道疾病之一,然而近些年来在我国及其他亚洲国家发病率急剧上升,且目前治疗IBD的药具有一定的副作用,如,利福昔明等具有肝肾毒性。广藿香醇（Patchouli Alcohol）是常用的芳香化湿药,有部分研究报道其具有抗炎作用,但其抗IBD的作用机制未见其详细报道,有待进一步深入探究。而目前已报道PXR抗IBD的作用,并且NF-κB和PXR有互作关系,在此基础上,本课题主要在体内外水平利用分子生物学手段,从PXR-NF-ΚB信号通路深入探讨广藿香醇的抗IBD作用。方法:1.广藿香醇对PXR及其靶基因/蛋白表达的影响首先,采用荧光素酶分析在HEK293T细胞中检测广藿香醇对PXR介导的CYP3A4启动子的活性,然后在LS174T细胞中利用RT-PCR、Western Blot技术检测hPXR、CYP3A4、MDR1的基因/蛋白表达情况,免疫荧光、UPLC-MS/MS分别检测CYP3A4表达和CYP3A4酶活性;接着以小鼠原代肝细胞为细胞模型,通过RT-PCR技术检测mPXR、Cyp3a11、Ugtlal的基因表达、免疫荧光技术检测Cyp3a11的蛋白表达;最后利用Western Blot、免疫荧光技术检测hPXR在LS174T细胞核和细胞质中的蛋白表达情况。2.沉默PXR后,广藿香醇对PXR及其靶基因/蛋白表达的影响RT-PCR 和 WB 法检测 PA对 siRNA-Control 和 siRNA-PXR转染后 LS174T 细胞中 hPXR和CYP3A4的基因、蛋白表达,UPLC-MS/MS技术检测PA对siRNA-Control和siRNA-PXR转染后LS174T细胞中CYP3A4的酶活性。3.广藿香醇对NF-КB及其下游炎症因子的影响以THP-1细胞为基础,LPS/TNF-α诱导炎症模型,利用RT-PCR技术检测NF-ΚB、IL-1 β、IL-6、COX-2、TNF-α 基因表达水平,利用 WB 技术检测 NF-ΚB、p-NF-ΚB、IΚBα、p-IΚBα蛋白表达量,利用WB、免疫荧光技术检测NF-КB在细胞核和细胞质中的蛋白表达情况。4.沉默PXR后,广藿香醇对NF-КB及其下游炎症因子的影响以LS174T细胞为模型,采用荧光素酶分析检测广藿香醇对PXR介导的CYP3A4启动子的活性,RT-PCR技术检测NF-ΚB、IL-1 β、COX-2、ICAM-1基因表达水平,利用WB技术检测NF-ΚB、p-NF-ΚB、IΚBα、p-IΚB α总蛋白表达量和NF-ΚB核蛋白、浆蛋白量;利用免疫荧光技术检测对siRNA-Control和siRNA-PXR转染后细胞中NF-K B在细胞核和细胞质中的表达量,RT-PCR技术检测对siRNA-Control和siRNA-PXR转染后细胞中hPXR、NF-K B、IL-1β、IL-6的基因水平。5.广藿香醇对DSS诱导的小鼠结肠炎的抗炎药效学研究C57BL/6小鼠连续灌胃给药9天,其中在第三天除了空白对照组外其他都给予4%DSS饮用,期间观察并记录小鼠的体重、便血率,造模和给药完成后,打开小鼠腹腔,剪取结肠部分,量结肠长度,作出DAI评分,HE染色考察PA对DSS诱导小鼠结肠炎的组织病理现象,试剂盒检测结肠组织中I1-1β、11-6、I1-10、Tnf-α的含量,RT-PCR检测结肠组织中I1-1 β、I1-6基因表达,免疫荧光检测组织中CD45、CD11b的表达。6.广藿香醇对DSS诱导的小鼠结肠炎的抗炎机制研究利用RT-PCR检测结肠组织中Cyp3a11、Ugtlal的基因表达量,利用免疫荧光检测结肠中Cyp3a11的表达量,通过荧光双染法检测结肠组织中NF-κ B、mPXR的表达量。7.药理学抑制PXR后,广藿香醇对DSS诱导小鼠结肠炎的抗炎作用研究小鼠分为以下几组:空白对照组、KET组、DSS组、DSS+KET组、PCN+DSS组、PCN+DSS+KET组、PA+DSS组、PA+DSS+KET组。按照以上分组,小鼠先KET灌胃给药2天,连续灌胃12天,然后从第3天灌胃PCN和PA,连续灌胃10天,并且第5天开始给予模型小鼠4%DSS（蒸馏水溶解）饮用,而对照组小鼠给予蒸馏水饮用。根据小鼠体重、便血等作出DAI评分,HE染色检测结肠组织病理变化,RT-PCR检测结肠组织中 mPXR、Cyp3a11、Ugtlal、Tnf-α、I1-6 的基因表达。结果:1.广藿香醇激活PXR信号中、高剂量PA能上调LS174T细胞中h-PXR介导的CYP3A4的启动子活性和CYP3A4酶活性,中、高剂量PA亦能够增加CYP3A4基因/蛋白表达,但对hPXR、MDR1基因/蛋白没有影响,说明了 PA可激活hPXR-CYP3A4信号。考虑到PXR的LBD域具有显著物种差异,因此,我们进一步研究了 PA是否能激活小鼠的mPXR信号。同样地,我们结果显示中剂量或高剂量PA上调小鼠原代肝细胞的Cyp3all和Ugtlal的基因表达,但对mPXR基因无作用,提示了 PA亦可激活小鼠的PXR信号。阳性对照hPXR激动剂（RIF）和鼠类PXR激动剂（PCN）亦发挥显著的诱导CYP3A4/Cyp3a11的作用。此外,机制研究显示不同剂量PA促进hPXR的表达转入细胞核中,进而诱导下游靶基因的表达。因此,我们结果显示了 PA可能是PXR的激动剂,可激活PXR信号。2.沉默PXR后,广藿香醇失去了激活hPXR信号的作用为了进一步探讨hPXR在PA调节CYP3A4诱导中所发挥的重要作用,我们进行了hPXR敲减实验。SiRNA-hPXR成功转染后,PA与RIF相似,均降低了 PA/RIF对CYP3A4基因、蛋白、酶活性的上调作用,结果表明了 PA对CYP3A4基因的诱导作用是依赖于hPXR的。因此,综上所述,hPXR在PA介导CYP3A4的表达作用是不可或缺的。3.广藿香醇抑制NF-КB调节的炎症信号PXR活化具有显著的抗炎作用,在IBD的抗炎治疗起着重要的调控作用。为了阐明PA是否具有抗炎作用,我们首先研究了在PA治疗后对NF-ΚB是否具有重要的抑制作用。LPS诱导能显著增加THP-1细胞中NF-КB、IL-1β、IL-6、COX-2、TNF-α基因表达水平,然而不同剂量PA干预细胞后降低了 LPS诱导的NF-КB、IL-1β、IL-6、COX-2、TNF-α基因的上调;与基因表达相一致,不同剂量PA降低了 LPS诱导的NF-κB、Iκ Bα蛋白磷酸化水平;此外,不同剂量PA能逆转LPS诱导的NF-κ B蛋白转入细胞核的功能。因此,我们结果显示PA可以显著抑制抑制NF-ΚB调节的炎症通路,发挥抗炎作用。4.广藿香醇通过激活hPXR信号发挥抑制NF-ΚB调节炎症PXR与NF-κ B互作,进而抑制NF-κ B的活性,是PXR发挥抗炎的重要机制。考虑到PA是PXR的激动剂,并且PA具有显著抑制NF-κ B信号作用,因此,我们猜测PA抑制NF-κ B发挥的抗炎作用可能是通过PXR活化来实现。因此,我们首先进行了PXR与NF-κ B互作研究。转染了 hPXR和NF-ΚB-luc质粒后,中、高剂量PA和RIF均能下调NF-ΚB-luc荧光素酶活性,提示了 hPXR可以显示抑制NF-КB信号。考虑到巨噬细胞中PXR的表达较低,我们采用了 LS174T细胞（一种含有较强内源性表达较强的PXR信号细胞）进一步测定PA抑制NF-κ B的作用是否通过激活hPXR来实验的。我们结果显示LPS诱导能显著增加LS174T细胞中NF-ΚB、IL-1β、COX-2、ICAM-1基因表达水平,然而,不同剂量PA激活LS174T细胞的hPXR信号后,可显著降低了LPS诱导的NF-ΚB转录水平,进而导致抑制NF-κB下游靶基因促炎因子如IL-1 β、COX-2、ICAM-1基因的mRNA水平;与转录水平一致,不同剂量PA和RIF活化hPXR后亦降低了 TNF-α诱导的NF-κ B、I κ Bα蛋白磷酸化水平。NF-ΚB的核易位是NF-KB调控下游靶基因促炎因子表达的重要机制,因此,阻止NF-ΚB的核易位在抑制NF-ΚB调节的炎症中起着关键的作用,我们结果显示了 PA可显著逆了 TNF-α诱导的NF-κB蛋白转入细胞核的功能。以上结果说明了 PA通过活化PXR作用导致可显著抑制NF-КB调节炎症信号。5.沉默PXR后,广藿香醇降低对NF-ΚB调节炎症通路的抑制作用为了进一步探讨hPXR在PA抑制NF-ΚB调节炎症信号中所发挥的重要调控作用,我们进行了 hPXR敲减实验。结果显示转染了 SiRNA-PXR后,PA不能逆转TNF-α诱导的NF-κ B蛋白转入细胞核,并且失去了下调TNF-α诱导的NF-ΚB、IL-1 β、IL-6基因的功能。因此,失去了 hPXR后,PA减弱了对抑制NF-КB调节炎症通路的调控作用,结果表明了 PA抑制NF-ΚB信号,发挥抗炎作用是需要hPXR参与的。6.广藿香醇改善DSS诱导的小鼠结肠炎前期体外研究PA有抗炎作用,本实验以DSS诱导小鼠结肠炎模型,单纯DSS诱导的小鼠表现出严重的结肠炎临床病理现象:体重在第4天明显下降、在第6天便血率急剧增加、结肠缩短、DAI疾病指数升高、结肠形态结构被严重破坏,然而PA或阳性药RIF治疗后,可以明显改善DSS诱导的这些结肠炎临床症状;进一步检测结肠组织中炎症因子的表达量,PA或阳性药PCN治疗后可明显降低DSS诱导的小鼠结肠组织中Il-1 β、Il-6、Il-10、Tnf-α的含量以及Il-1β、Il-6的mRNA表达量,此外通过免疫荧光显示,PA或PCN治疗后降低了 CD45、CD11b的蛋白表达量。以上结果显示PA具有显著降低DSS诱导的炎症以及改善DSS诱导的炎性肠病作用。7.广藿香醇调控DSS诱导小鼠结肠的PXR/NF-КB信号为了阐明PA通过激活mPXR抑制NF-κ B信号传导的体内机制,我们测定了 PA对小鼠结肠组织mPXR和NF-κ B信号传导的影响。首先测定了小鼠结肠组织中mPXR靶基因-Cyp3a11、Ugtlal基因表达,结果显示单纯性给药PA或PCN能够明显提高小鼠结肠组织中Cyp3a11、Ugtlal的基因表达;进一步通过免疫荧光结果观察到,PA或PCN增加了 DSS诱导的小鼠结肠组织中Cyp3a11的蛋白表达;而且,荧光双染实验结果表明,PA或PCN抑制了 DSS诱导的小鼠结肠组织NF-κ B的蛋白表达、促进了 mPXR的蛋白表达。以上结果表明PA激活了 mPXR,抑制了 NF-κ B信号通路。8药理学抑制PXR后降低了广藿香醇改善DSS诱导小鼠结肠炎我们通过用PXR拮抗剂KET药理学抑制对PXR信号的传导,观察PA是否可以减轻对DSS诱导的结肠炎的保护作用。结果显示,DSS诱导的小鼠增加了结肠炎的易感性:体重减轻、严重腹泻、结肠缩短、DAI指数升高、结肠组织病理损伤和大量炎症细胞浸润,PCN或PA给药后有效地缓解了 DSS诱导的以上这些结肠炎临床病理现象,而小鼠预处理PXR药理学抑制剂-KET,PA不能缓解结肠炎的临床表现;进一步探究抑制mPXR后PA对mPXR靶基因调控情况,结果表明,预处理KET,抑制了 mPXR的mRNA表达,PA不能上调小鼠结肠组织中Cyp3a11、Ugtlal的mRNA表达,PA抑制了 mPXR信号通路;而且通过对结肠组织中炎症因子基因水平的测定,表明预处理KET减弱了PA 抑制 Tnf-α、Il-6mRNA 的作用。结论:PA是PXR的激动剂,PA对DSS诱导的小鼠结肠炎具有抗炎药效,且其抗结肠炎机制是通过激活PXR抑制NF-κ B信号通路来实现的。