前言缺血预适应(Ischemic Preconditioning, IP)是指某一组织预先反复短暂缺血／再灌注(Ischemic/Reperfusion, I/R)后,可以延缓或减轻该组织对后续缺血／再灌注损伤的现象,表现为实质组织、细胞死亡明显减少,梗死范围大幅度缩小,器官功能障碍明显减轻等。红霉素可以通过干扰线粒体的能量代谢从而模拟缺血诱发预适应的保护作用,产生红霉素预适应现象。Cyt c是第一种被发现的线粒体释放的促凋亡蛋白。在线粒体损伤后,Cyt c作为应激传感器被释放到胞质中,从而引发细胞执行凋亡程序,在此途径中Cyt c发挥了关键性作用。本实验的目的,红霉素预适应作用下,根据Cyt c促凋亡因子改变的多少,判断红霉素是否作用于线粒体,产生的效果。方法一、实验动物及分组健康、雄性SD大鼠,体重250-300克(中国医科大学实验动物中心)。将动物随机分成红霉素组(红霉素预适应12小时,假手术,24小时之后取材)、缺血组(手术,缺血2小时,再灌注24小时后取材)、红霉素缺血组(红霉素预适应12小时,手术,缺血2小时,再灌注24小时后取材)、正常对照组(假手术),每组5只动物。二、大鼠缺血模型的建立采用Longa法大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,选用23.5mm鱼线,将阻塞端灼烧成梭型。按手术步骤暴露右侧CCA(颈总动脉)、ECA(颈外动脉)和ICA(颈内动脉),从ECA(颈外动脉)插线,栓塞右侧大脑中动脉。线栓深度距CCA(颈总动脉)分叉约18±1mm,正常组除不插线外其他步骤相同。线栓保留2 h后,小心拔除到颈总动脉分叉处恢复血流。三、神经功能评分观察模型大鼠清醒后的行为学改变,按Longa五级四分法评定动物神经功能,即：0分：不能自发的行走；1分：自由走动状态下向病变对侧旋转；2分：抓住鼠尾,大鼠向病变对侧旋转；3分：对于施向病变对侧的侧压力抵抗力下降的；4分：不能伸直病变对侧的前爪,甚至全身向对侧屈曲；5分：无神经功能的缺损。本实验将第0、1、2、3、4分大鼠确定为成功模型。四、TTC染色大鼠处死后,取出脑组织放入-20℃速冻20分钟,以冠状位,每隔2mm切片(6片)。切片放置2%TTC液中,避光放入37℃温箱30min,每隔10min翻动脑片,使脑片均匀接触到染色液,4%多聚甲醛固定保存(保存时间小于一周)。五、脑组织梗死体积测定应用图像分析软件计算脑梗死面积和各层组织,由公式V=∑(A+B)C／2,算出梗死体积,A和B分别表示切片的上下梗死面积,C为切片的厚度,用此方法计算出同层脑片体积,计算出梗死灶体积占全脑体积的百分比。六、免疫组化Cyt c表达的检测,蒸馏水新鲜配置3% H2O2,室温浸泡5-10min以灭活内源性酶,TTBS液冲洗,滴加正常山羊血清工作液,不洗,甩去多余液体；滴加兔抗鼠Cyt c一抗(1：100 ABZOOM公司),然后在4℃下过夜,TTBS洗；滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司二抗试剂盒)室温下30min,TTBS洗；滴加试剂SABC,室温下30min,TTBS洗10min×3次；DAB显色(北京中杉金桥生物技术有限公司),室温下15min,双蒸水多次洗涤；脱水、透明,中性树胶封片。显微镜下观察,阳性细胞胞浆呈棕黄色颗粒。TTBS液代替一抗作阴性对照。七、观察结果及统计学处理Cyt c阳性反应部位在胞浆呈棕色或深黄色。在高倍镜下计数单位面积阳性细胞数,所获数据用SPSS13.0统计软件进行Levene Test方差分析,t检验取P<0.05为显著性差异标准。结果一、脑梗死体积测定结果TTC染色实验中,经过25mg／kg剂量的红霉素预适应缺血组,其脑梗死梗死体积较单纯缺血组梗死体积有不同程度的减少,而且P<0.05,缺血梗死体积减少,有统计学意义。二、神经功能评分大鼠的神经功能中,采用Longa法大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,本实验将第0、1、2、3、4分大鼠确定为成功模型。缺血组(手术,缺血2小时,再灌注24小时后取材)、红霉素缺血组(红霉素预适应12小时,手术,缺血2小时,再灌注24小时后取材)。两组相比,红霉素显著的改善了大鼠的神经功能缺损(P＜0.05)。三、免疫组化大鼠大脑皮层中,Cyt c阳性反应部位在胞浆呈棕色或深黄色,在高倍镜下计数,缺血组明显比红霉素缺血组表达增多(P<0.05),红霉素组阳性表达高于正常对照组(P<0.05)。推断Cyt c在红霉素预适应中可能经过线粒体途径,从而达到对大鼠神经的保护作用。结论1、提前12小时的红霉素预适应会对脑缺血起到保护作用,红霉素可以防止细胞凋亡的进一步发展,有效的改善脑功能状态,减少脑缺血后脑梗死体积。2、红霉素预适应可以诱导大鼠局部脑缺血,产生缺血耐受性,Cyt c可能通过线粒体参与了这一过程的调节。