东北刺人参不定根总黄酮提取物介导合成的银纳米颗粒抑菌和抗生物膜研究

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东北刺人参是长白山区一种珍稀药用植物,属于国家二级和吉林省一级保护植物。不定根(AR)培养是获取东北刺人参植物材料的重要途径,为了将培养的AR应用于实际生产中,对AR的提取方法及条件、生物活性等方面进行研究具有重要的意义。闪式提取技术是一种基于植物组织破碎原理的新型提取方法,具有提取速度快、提取率高等优点。因此,本研究对东北刺人参AR进行了闪式提取,利用响应面设计法对提取溶剂(乙醇)浓度、提取时间及液料比进行了条件优化,旨在提高东北刺人参AR闪式提取效率,为今后工业化提取提供理论依据。进一步,利用闪式提取的不定根提取物(ARE)和Ag NO3生物合成了银纳米颗粒(ARE-Ag NPs),通过调控ARE浓度、Ag NO3浓度、反应温度和反应时间,确定了适宜的ARE-Ag NPs合成条件。最后,对ARE-Ag NPs的抑菌活性及其机制、抗生物膜作用等进行了探究,为今后将ARE-Ag NPs应用于抑菌产品的开发和生产提供参考依据。闪式提取研究中,以不定根提取物中黄酮得率为响应值,根据响应面法对乙醇浓度、提取时间及液料比设计了17个组合,并进行提取,根据回归模型得到的优化组合是:提取时间为69 s,乙醇浓度为62.7%,料液比为57 m L·g-1,此条件下黄酮得率的预测值为7.12%,经验证黄酮得率为7.08%。对闪式提取方法与传统提取方法进行比较的结果为,闪式提取法得到的提取物的黄酮得率显著高于(p<0.05)热水浸提法和超声波热辅提取法得到的提取物。结果表明,闪式提取技术可用于今后东北刺人参不定根的工厂化提取中。利用ARE和Ag NO3生物合成Ag NPs时,ARE浓度、Ag NO3浓度、反应温度和反应时间对ARE-Ag NPs合成有很大影响,经筛选得到适宜的条件是:ARE浓度为1.5 mg·m L-1,Ag NO3浓度为1 mmol·m L-1,反应温度为95°C,反应时间为3 h。进一步,对ARE-Ag NPs进行了表征。紫外-可见光谱及X射线衍射分析结果证明了ARE-Ag NPs的成功合成;傅里叶红外光谱分析表明ARE中酚类、黄酮类、蛋白质等物质参与了ARE-Ag NPs的还原和封端;经扫描电子显微镜观察,ARE-Ag NPs大多呈球形,平均粒径为35.87 nm。ARE-Ag NPs的抑菌活性研究表明,ARE-Ag NPs具有强抑菌效果。在6种试验菌,即金黄色葡萄球菌(Sa)、猪霍乱沙门氏菌(Sc)、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌(Ec)、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌(Pa)中,ARE-Ag NPs对Ec和Pa的最低抑菌浓度(MIC)最低;2种菌混合的12组中,ARE-Ag NPs对Sa+Sc、Sa+Pa和Sc+Ec的MIC最低;3种菌混合的2组中,ARE-Ag NPs对Sa+Ec+Pa的MIC最低。进一步,利用Ec、Pa、Sa+Sc、Sa+Pa、Sc+Ec、Sa+Ec+Pa研究了ARE-Ag NPs的抑菌机制。经扫描电镜观察发现,ARE-Ag NPs处理后,细菌出现变形、皱缩等异常形态;ARE-Ag NPs处理后,菌胞外碱性磷酸酶活性、电导率、核酸和蛋白质浓度显著提高(p<0.05),表明胞内物质的泄露;对呼吸抑制率进行调查的结果,发现ARE-Ag NPs可明显抑制菌呼吸。这些研究结果表明,ARE-Ag NPs通过破坏菌细胞完整性、提高细胞膜渗透性及抑制菌呼吸起到了抑菌作用。利用Ec、Pa、Sa+Sc、Sa+Pa、Ec+Sc、Sa+Ec+Pa研究了ARE-Ag NPs抗生物膜的作用。经ARE-Ag NPs处理后,所用试验菌的生物膜形成量均显著减少(p<0.05),同时ARE-Ag NPs对形成的生物膜具有强清除能力。对生物膜菌胞外多糖含量进行测定的结果,发现经ARE-Ag NPs处理后菌胞外多糖含量显著降低(p<0.05)。综上所述,ARE-Ag NPs具有强抑菌及抗生物膜的作用,是一种可用于抑菌产品开发和生产的良好材料。
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