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目的:毛兰素(Erianin)是一种提取自名贵中药材铁皮石斛和鼓槌石斛的天然小分子化合物。目前研究表明毛兰素对多种癌症,肿瘤血管生成,微生物感染以及糖尿病肾病等多种疾病都有一定的治疗效果,但是对于毛兰素具体的作用机制与作用靶点仍鲜有报道。本文主要探讨毛兰素的在人肝癌HepG2细胞中的靶蛋白的鉴定与研究。方法:首先将以毛兰素类似物为活性基团的活性探针与非活性探针通过对HepG2细胞裂解液的pull down以及质谱鉴定找出能与活性探针特异性结合的蛋白;利用Discovery studio 2016 v16.1分子对接模拟软件对人丙酮酸羧化酶(hPC)进行同源建模,并将其模拟的结构与毛兰素对接并分析结果;利用慢病毒表达载体与RNA干扰载体以及慢病毒包装策略,在HepG2细胞中将该蛋白过表达以及干扰该蛋白的表达,以探究该蛋白在HepG2细胞中表达量的变化对毛兰素处理的响应;利用真核表达体系与相应标签的亲和纯化凝胶珠将该蛋白表达纯化,在体外进一步研究其与RH活性探针以及未经修饰的毛兰素小分子的相互作用。结果:通过对活性探针与非活性探针的pull down结果中的差异蛋白的质谱鉴定结果的分析,确定了与该活性探针相互作用的蛋白为丙酮酸羧化酶蛋白(PC);获得了人丙酮酸羧化酶(hPC)的同源结构模型;分子对接模拟显示hPC能通过常规氢键、碳氢氢键、π-阴离子互作、π-二硫键互作和π-烷基互作同毛兰素结合;构建了慢病毒表达载体pLVX-puro-flag-PC与RNA干扰载体pENTRTM/U6-shPC1/2,在与pMD2.G和psPAX2共转染后,获得了滴度较高的慢病毒液;经慢病毒感染与嘌呤霉素筛选后,获得了能稳定表达能稳定表达flag-PC的HepG2/flag-PC细胞系;MTT法对毛兰素处理48 h的HepG2/flag-PC细胞以及shPC2慢病毒感染的HepG2细胞进行的细胞存活率检测结果表明,毛兰素的细胞毒性与PC的表达量呈正相关;将HepG2/flag-PC细胞大量传代培养后,利用anti-flag亲和凝胶珠从细胞裂解液中纯化得到了纯度非常高的flagPC蛋白;将活性探针与非活性探针分别与纯化的flag-PC蛋白孵育并交联后引入RH荧光基团,SDS-PAGE凝胶电泳后经凝胶荧光成像系统扫描发现,flag-PC蛋白能与大量的活性探针结合,而非活性探针组只有微弱的荧光;将未经修饰的毛兰素小分子直接与纯化的flag-PC蛋白共同孵育后,PC酶活性显著下降。结论:我们在实验中确定了基于毛兰素类似物合成的探针能特异性地捕获HepG2细胞中的PC蛋白;分子对接结果也显示毛兰素能与hPC相互作用;在HepG2细胞中,毛兰素的细胞毒性与PC的表达量呈正相关;纯化的flag-PC蛋白也能在细胞外与活性探针特异性结合;毛兰素还能显著影响PC酶活性。本研究基本确定了毛兰素在HepG2细胞中的靶蛋白为PC蛋白,为深入研究毛兰素的抗癌机制的奠定了基础。