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马尾松树皮提取物(Pinus massoniana bark extracts,PMBE)是从野生马尾松树皮中提取的多酚类物质,其主要活性成份是原花青素,由单体、寡聚体和多聚体等天然类黄酮组成的混合物。已经有各种资料记载马尾松树皮具有收敛、止血和解毒的功效,可以用来治疗风湿性关节炎、高血压、冻疮等疾病。研究证明,多种类黄酮混合可显示出加合效果,是作为天然抗氧化剂,清除自由基的最佳选择。
本文首先用HPLC法测定PMBE中与抗炎症相关的几种生物活性物质,结果发现其中含有紫杉叶素(taxifolin)、表儿茶素(Epicatechin,EC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin galloate,EGCG),这三种类黄酮的含量分别为1.27%、4.8%和0.55%。
其次,探讨血清饥饿法对人表皮角质细胞HaCaT细胞周期的影响。用倒置显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪分析细胞周期各个时相细胞百分比。结果发现:HaCaT细胞在含0.2%FBS的DMEM培养基中培养12h,细胞仍然贴壁生长,并且可以使G0/G1期细胞百分率达到66.5%。接着,探讨PMBE对人表皮角质细胞HaCaT的细胞毒性。用倒置显微镜观察PMBE对细胞形态的影响;用CCK-8检测PMBE对细胞生长的抑制率;用流式细胞仪测定细胞周期。结果发现:PMBE对HaCaT细胞的生长和增殖具有剂量和时间的依赖关系。在一定浓度范围内(10~80μg/ml)的PMBE处理人表皮角质细胞HaCaT 24h内没有细胞毒副作用。
再次,研究PMBE、紫杉叶素对细胞间黏附分子ICAM-1的表达影响。用1000U/ml的IFN-γ处理人的表皮角质细胞HaCaT 24h可以明显地诱导ICAM-1的表达。用40μg/ml PMBE预处理HaCaT 24h可以抑制IFN-γ诱导的ICAM-1的表达。通过RT-PCR和Northern印迹检测ICAM-1 mRNA的表达,发现在含有等量紫杉叶素情况下,PMBE比紫杉叶素对诱导型ICAM-1 mRNA表达的抑制效应强,而在等浓度(40μg/ml)条件下,紫杉叶素单体的浓度相当于混合物PMBE中紫杉叶素含量的79倍,然而PMBE还是比紫杉叶素抑制诱导型ICAM-1 mRNA表达强;通过流式细胞术、免疫细胞化学、免疫印迹检测ICAM-1蛋白的表达,发现在含有等量紫杉叶素的情况下,PMBE抑制ICAM-1蛋白的表达比紫杉叶素强约2.24~2.30倍;在均为40μg/ml(13μM)条件下,PMBE抑制ICAM-1蛋白的表达比紫杉叶素强约2.60~3.00倍。说明PMBE可以抑制IFN-γ诱导的ICAM-1mRNA和蛋白的表达,由此提示PMBE中多种有效活性成份可以共同起作用而抑制诱导型ICAM-1的表达,从而具有抗炎症效应。再次,初步研究PMBE对细胞培养液中NO和细胞内NOS表达的影响。通过酶联免疫法检测NO的表达,发现不同浓度的PMBE对IFN-γ、IL-1B和LPS诱导的NO都具有抑制作用;同时激光共聚焦显微镜和流式细胞仪的检测结果表明PMBE对IFN-γ诱导的NOS也具有抑制作用,由此推测PMBE可能通过抑制NOS的表达而抑制NO的产生。
最后,初步研究PMBE抑制ICAM-1和NOS表达的信号通路。通过荧光显微镜的方法检测PMBE对炎症细胞的凋亡影响,结果发现PMBE并不引起炎症细胞的凋亡。免疫印迹检测转录因子NF-κB的表达,用800U/ml IFN-γ刺激HaCaT细胞24h,结果发现能够激活NF-κB转录因子的表达,而PMBE、紫杉叶素、EGCG预处理细胞均不能引起细胞中磷酸化的IκBa(Ser32)和非磷酸化的IκBa的变化。由此,初步推测PMBE下调ICAM-1和NOS表达可能与NF-κB转录因子无关。