论文部分内容阅读
旋毛形线虫（Trichinella spp.）,又称旋毛虫,截至目前已分离鉴定出13种不同的类群[1]。根据其生活史中肌幼虫期是否在宿主肌细胞重组过程中形成包囊主要被分为两个进化枝,即有包囊虫种和无包囊虫种。旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）和伪旋毛虫（Trichinella pseudospiralis,T4）作为两大进化枝的代表虫种,其区别除是否形成包囊外,还在于易感宿主和感染后炎症反应的差异。就目前的流行病学调查发现T4是旋毛虫种属中唯一一个可以感染鸟类的虫种,其余则仅寄生于脊椎哺乳动物宿主。造成以上差异的原因很可能是由于虫种间排泄分泌物（excretory-secretory products,ESP）不同所致。ESP成分复杂,又直接暴露于宿主免疫系统,参与机体细胞调控,与寄生虫的寄生生活和致病性密切相关。此外旋毛虫ESP对自身免疫性疾病具有显著的预防及治疗效果[2]。由于虫体直接寄生会对患者造成一定的心理、病理损害,加之旋毛虫衍生蛋白成分、浓度难以控制,导致相关研究及应用受限。那么鉴定筛选旋毛虫ESP中的功能性蛋白分子则既可避免旋毛虫感染带来的危害,又可代替旋毛虫寄生为治疗自身免疫疾病提供新思路和新方向。本实验预期从T1、T4排泄分泌物入手,从蛋白质水平初步筛选影响包囊形成和/或参与免疫调节的相关蛋白分子。首先进行T1、T4肌幼虫时期排泄分泌物的收集,SDS-PAGE鉴定ESP蛋白质量后利用iTRAQ技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation）对二者进行蛋白鉴定以及差异表达蛋白的筛选。该过程共鉴定到蛋白1027个,T1中表达上调蛋白163个,T4中表达上调蛋白31个。T1中表达丰度较高的有DNaseⅡ家族（包括具有DNaseⅡ活性的Plancitoxin-1）、丝氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶抑制剂、胱抑素样蛋白、烯醇酶、热休克蛋白、核苷酸酶等;T4上调表达的主要有钙粘蛋白、DNaseⅡ、Moesin/ezrin/radixin蛋白、β-己糖胺酶、组蛋白H2B/H4等。为验证iTRAQ鉴定结果的准确性,对选取的9个蛋白的编码基因采用实时荧光定量PCR进行转录水平的验证。结果与蛋白表达水平相符,证实了iTRAQ结果的可靠性。随后选取了旋毛虫胱抑素样蛋白进行后续的初步探索。根据pET22b质粒成功构建出重组旋毛虫胱抑素样蛋白-pET22b表达载体,利用大肠杆菌表达出重组旋毛虫胱抑素样蛋白。生物信息学分析显示旋毛虫胱抑素样蛋白共由237个氨基酸组成,蛋白质量27.6 kDa,理论等电点8.02,N端具有1-18位氨基酸的信号肽。蛋白细胞亚定位显示其位于细胞质。具有5个酪蛋白激酶II磷酸化位点;3个N-肉豆蔻酰化位点;3个蛋白激酶C磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。无保守的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,与现存的几种寄生性线虫的cystatin同源性极低。该蛋白可能为一种新型旋毛虫分泌型胱抑素样蛋白。之后使用重组旋毛虫胱抑素样蛋白免疫家兔获得抗血清,利用抗血清对虫体的间接免疫荧光实验发现该蛋白定位于虫体表面及包囊上。最后,使用重组旋毛虫胱抑素样蛋白免疫小鼠,三次免疫后进行攻虫计算减虫率探究旋毛虫胱抑素样蛋白对小鼠的保护作用。减虫率显示旋毛虫胱抑素样蛋白免疫组平均每只小鼠检获肌幼虫与PBS和佐剂对照组在分别感染T1、T4后相比均有显著性差异（P<0.05）,T1肌幼虫减虫率达到60.54%,T4肌幼虫减虫率达到37.49%。旋毛虫重组胱抑素样蛋白对T1感染小鼠有较好的减虫效果。综上所述,本研究一方面对旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物的差异蛋白进行了总体分析,另一方面发现一种定位于旋毛虫虫体和包囊上的新型重组旋毛虫胱抑素样蛋白,它对旋毛虫和伪旋毛虫分别感染的小鼠有较好的减虫效果。