一.目的宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,在全球妇女中,宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌居第二位,严重威胁广大妇女的生命健康。据保守估计,全球每年约新增加50万例临床确诊的宫颈癌病例,其中大部分发生在发展中国家。我国每年新增宫颈癌患者约13万,每年约有5万人死于宫颈癌。近年来我国宫颈癌的发病率明显上升,且发病年龄逐渐年轻化,呈双峰状分布,即35-39岁和60-69岁。宫颈癌的主要特点是局部蔓延,早期的侵袭转移往往使患者错过了最佳的手术时机。因此,寻找一种抗宫颈癌侵袭的药物将成为成功治疗宫颈癌的关键。白藜芦醇是一种多酚化合物,是植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害时自身分泌的一种植物抗毒素。研究表明,白藜芦醇具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、雌激素样、免疫调节等多种生物学功能,在肿瘤的启动、发生和发展三个阶段均发挥强大的抗肿瘤作用。其主要活性表现为：1)抑制细胞色素酶：细胞色素P450能够通过氧化作用使某些致癌物质如BaP转变为高度致突变衍生物并释放自由基,导致DNA氧化损伤。白藜芦醇是细胞色素P450抑制剂,可阻止这一过程的发生；2)诱导谷胱甘肽-S-转移酶、尿嘧啶-双磷酸葡萄糖酸基转移酶等解毒酶活性,使致癌物解毒；3)抑制环氧合酶(COX)：白藜芦醇可通过阻碍核转录因子NF-Kb的活化抑制COX表达,从而抑制环氧合酶活性;4)抑制蛋白激酶活性：酪氨酸蛋白激酶(PTK)能激活ATP末端磷酸,使底物蛋白质的酪氨酸残基磷酸化,这一过程在肿瘤基因表达的信息传递中起重要作用,许多恶性肿瘤细胞都发现有某种特定的PTK被激活或过量表达。白藜芦醇可通过非竞争性结合机制抑制PKC的活性从而达到抗肿瘤的作用。近年来,白藜芦醇在防治肿瘤方面显示出巨大的潜力,其作用机制的研究逐渐得到关注。然而,目前的研究多集中于白藜芦醇对肿瘤细胞增殖的影响,对肿瘤细胞侵袭的影响及其作用机制知之甚少。关于白藜芦醇对宫颈癌细胞侵袭转移作用的研究目前尚属空白。开发白藜芦醇的抗宫颈癌作用,为宫颈癌的生物学治疗提供更多一种可供选择的药物,是一项有价值的工作。本研究将白藜芦醇作用于体外培养的宫颈癌HeLa细胞及HeLa细胞荷瘤鼠模型,观察其对宫颈癌细胞侵袭的影响,探讨作用机制,摸索合理的用药浓度,为白藜芦醇在临床上的应用提供实验依据。二.实验材料及方法第一部分：首先应用不同浓度的白藜芦醇作用于宫颈癌HeLa细胞,采用MTT法检测白藜芦醇对细胞生长的影响,计算出药物的半量抑制浓度(IC50)。根据药物对细胞生长的抑制情况联合药物的IC50值,我们将对细胞增殖影响较小的药物浓度作为后续检测白藜芦醇对宫颈癌细胞侵袭转移影响的实验药物浓度。白藜芦醇处理HeLa细胞24h后,transwell侵袭实验检测宫颈癌细胞侵袭能力的改变情况；逆转录PCR (RT-PCR)、Western blot及酶谱法分别检测与肿瘤细胞侵袭密切相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)-2、-9,基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)-1、-2mRNA、蛋白及酶表达活性的改变情况,计算MMP-2/ TIMP-1、MMP-9/TIMP-2值,探讨基质金属蛋白酶与其组织抑制剂之间的平衡与宫颈癌侵袭之间的关系；扫描电镜观察白藜芦醇对宫颈癌HeLa细胞板状伪足的影响,逆转录PCR (RT-PCR)及Western blot检测诱导板状伪足产生的表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)基因及蛋白表达水平；同时采用逆转录PCR (RT-PCR)及Western blot检测维持肿瘤细胞自稳状态的钾氯共转运载体(K-Cl cotransport carrier, KCC)的基因及蛋白表达水平,为白藜芦醇在临床上的应用提供实验依据。第二部分：应用双荧光素酶基因报告实验,研究白藜芦醇对宫颈癌HeLa细胞过氧化物酶体增殖物激活受体y(Peroxisome proliferators-activated receptor, PPARy);活性的影响。逆转录PCR (RT-PCR)及Western blot法检测白藜芦醇对宫颈癌细胞PPARy表达水平的影响。进一步应用逆转录PCR (RT-PCR)及Westernblot法检测应用PPARγ拮抗剂预处理后的宫颈癌细胞信号转录因子及活化子3(Signal transducer and activator of transcription, STATs)、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Ecto-matrix metalloproteinases inducing factor, EMMPRIN)及MMP基因及蛋白的表达水平,探讨PPARy依赖的JAK-STAT3信号转导通路在白藜芦醇抑制MMP表达及活性中的作用。第三部分：构建宫颈癌HeLa细胞荷瘤鼠模型,采用腹腔给药的方法每日注射不同浓度的白藜芦醇。观察荷瘤鼠的一般状态及肿瘤的生长情况。逆转录PCR(RT-PCR)及Western blot法分别检测瘤组织MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达的改变情况。免疫组化方法检测瘤组织微血管形成情况,了解白藜芦醇在体内对宫颈癌的影响。同时留取荷瘤鼠眼眶静脉血,应用ELISA方法进行肝肾功能检测,评价白藜芦醇在体内的药物毒性。三.结果第一部分：MTT法检测白藜芦醇对细胞的生长抑制情况,结果表明,白藜芦醇的半量抑制浓度(IC50)为0.8638mmol/L。浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L的白藜芦醇对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率分别为27.78%、45.89%、55.13%。联合分析细胞生长的抑制情况及药物的IC50值,我们将后续检测白藜芦醇对宫颈癌细胞侵袭影响的实验药物浓度确定为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L。采用上述三个浓度的白藜芦醇处理细胞24h后,检测HeLa细胞侵袭能力,结果表明,白藜芦醇能够以剂量依赖的方式抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭。进一步对白藜芦醇抑制宫颈癌细胞侵袭能力的作用机制进行探讨,发现随着白藜芦醇剂量的增加,肿瘤细胞侵袭转移所必备的细胞装配——细胞板状伪足的质量明显降低,诱导板状伪足生成的EGF基因及蛋白的表达水平亦明显减少；研究同时发现,白藜芦醇能够以剂量依赖的方式抑制宫颈癌HeLa细胞MMP-2、MMP-9基因、蛋白的表达水平及酶活性,提高TIMP-1、TIMP-2基因、蛋白的表达水平及酶活性,降低MMP/TIMP值,恢复两者之间的平衡关系；与此同时,白藜芦醇能够抑制肿瘤细胞KCC-1 mRNA及蛋白的表达水平,破坏肿瘤细胞自稳状态的维持,降低宫颈癌细胞的侵袭能力。第二部分：研究表明,白藜芦醇能够以剂量依赖的方式提高PPARy的活性及表达水平。研究同时发现白藜芦醇对STAT3基因及蛋白表达无明显影响,但能够以剂量依赖的方式抑制STAT3蛋白磷酸化,同时抑制EMMPRIN和MMP基因及蛋白的表达水平。应用RT-PCR及Western blot法检测PPARy拮抗剂(GW9662)预处理后的宫颈癌细胞STAT3、EMMPRIN及MMP基因及蛋白的表达水平,结果表明抑制PPARy活性后,白藜芦醇对HeLa细胞STAT3蛋白磷酸化及EMMPRIN、MMP基因及蛋白表达的抑制作用消失。第三部分：成功构建宫颈癌HeLa细胞荷瘤鼠模型,采用腹腔给药的方法每日注射不同浓度的白藜芦醇。结果表明,白藜芦醇能够以剂量依赖的方式抑制荷瘤鼠模型肿瘤生长。结果同时表明,随着白藜芦醇剂量的增加MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达水平降低,瘤组织微血管的形成明显减少。与此同时,白藜芦醇对机体的肝肾功能没有明显的影响。四.结论第一部分：(1)白藜芦醇能够以剂量依赖的方式抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭能力；(2)白藜芦醇能够明显抑制宫颈癌细胞MMP-2、MMP-9的表达及活性,提高TIMP-1、TIMP-2表达及活性,降低MMP/TIMP值,恢复两者之间的平衡关系,降低MMP对细胞外基质的降解能力；(4)白藜芦醇能够抑制由EGF诱导的肿瘤细胞板状伪足的形成；(5)白藜芦醇作用后,维持细胞自稳状态的KCC1基因及蛋白的表达水平明显下降,有效抑制宫颈癌细胞的侵袭转移。第二部分：(1)白藜芦醇能够明显提高宫颈癌HeLa细胞PPARy的表达及活性；(2)白藜芦醇能够通过PPARy依赖的JAK-STAT3信号转导通路影响MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表达及活性。第三部分：(1)白藜芦醇能够在体内明显抑制宫颈肿瘤的生长；(2)在体内白藜芦醇能够明显降低MMP-2、MMP-9的基因及蛋白表达水平；(3)白藜芦醇在体内抑制宫颈癌的生长与明显抑制肿瘤组织微血管的形成密切相关；(4)白藜芦醇对机体正常组织细胞不会产生明显的毒副作用。