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脂肪组织不仅参与机体能量贮存与代谢,而且还具有重要的内分泌功能。脂肪组织的过度增加是导致肥胖的重要原因。研究脂肪细胞分化的机制可为有效地控制肥胖和治疗相关并发症提供分子生物学理论基础。脂肪组织的增长包括脂肪细胞体积的增大和脂肪细胞数量的增多。3T3-L1细胞系常被用于体外前脂肪细胞分化成为脂肪细胞机制的研究。以往研究表明,体外培养3T3-L1前脂肪细胞至接触抑制后,给予混合诱导剂刺激,前脂肪细胞可重新进入细胞周期进行有丝分裂克隆扩增(mitotic clonal expansion, MCE),经过约两轮(每轮约28小时)细胞分裂增殖后进入终末分化阶段,表达脂肪细胞标志基因(C/EBPα PPARγ等)并形成成熟的脂肪细胞。然而,前脂肪细胞被诱导后再次进入细胞周期进行克隆扩增的具体调节机制仍不完全清楚。本课题关注于3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中最初28小时内变化调节机制的研究,主要包括以下三个方面：一、3T3-L1前脂肪细胞分化早期蛋白质差异表达的动态变化iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation,同位素标记相对和绝对定量)技术是近年研发出的一种差异蛋白质组学技术,可用于同时比较4-8组样品所含蛋白质的种类和含量,尤其适用于低丰度蛋白质差异表达的动态变化研究。本课题利用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术作为主要检测技术手段,对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化最初28小时内蛋白质水平发生的变化进行了全面的分析研究。在考察比较不同蛋白质纯化方法的回收率、重复性以及纯化效率的基础上,我们选用丙酮沉淀法对标记前的样本进行纯化,采用iTRAQ 8标技术对0、4、8、12、16、20、24和28小时八个检测点的蛋白质提取物分别进行标记,用AB SCIEX Triple TOFTM 5600质谱仪作为主要仪器分析检测,并用QSTAR XL质谱仪进行比对分析,确证定量结果的可信度,共定量得到了3152个非冗余蛋白。二、脂肪细胞分化MCE中转录调控网络与关键调控因子利用生物信息学技术对全部定量蛋白进行全局箱型图分析和全局主成分分析,结果表明0、12、16、20、24和28小时六个检测点主成分的分布相对集中,适合进行比较分析。结合FACS监测细胞所处细胞周期阶段的实验结果,即3T3-L1前脂肪细胞在诱导后约16小时开始实现G1/S期跨越进入S期并在诱导后20小时达到高峰,我们以20小时为差异蛋白表达最高或最低点,设计了先上升然后持平、先下降然后持平、先上升然后下降和先下降然后上升四种筛选差异蛋白的模式。经筛选,共有595个差异蛋白符合设定的模式。对符合模式蛋白和全部蛋白进行分子量(MW)和等电点(pI)的分析比较,结果表明符合模式的595个差异蛋白没有偏性,和全局3152个非冗余蛋白的理化性质相近,适合进行更深入的生物信息学分析及生物学功能验证。C/EBPβ是脂肪细胞分化过程中重要的转录因子,可转录激活C/EBPα、 PPARy这两种脂肪细胞终末分化的关键因子,且其表达和活化对前脂肪细胞MCE是必需的。之前本课题组已通过ChIP-on-chip技术寻找C/EBPβ在脂肪细胞分化早期所作用的靶基因,并采用基因表达谱芯片技术进行确证,获得了68个潜在的C/EBPβ调控3T3-L1前脂肪细胞MCE的靶基因。通过将本课题iTRAQ-2DLC-MS/MS分析结果与上述基因芯片检测数据相比较,我们从蛋白质水平与mRNA水平高通量检测结果进行相互验证并进一步筛选。最终,三种高通量检测数据交汇得到17个蛋白,其中PKM2和RRP1B两个蛋白符合设定模式。使用IPA数据库对符合模式蛋白进行GO功能富集分析发现,模式蛋白比较显著的富集功能主要涉及胚胎发育、多种疾病(肝病、心血管病、恶性肿瘤等)、骨骼肌肉系统发育、心血管系统发育等,提示这些富集功能中的模式蛋白与生殖发育及一些异常的生理过程包括细胞死亡、异常增殖等有关。通路富集分析结果表明,模式蛋白在PI3K/AKT/mTOR及相关信号通路显著富集。根据GO功能富集分析、通路富集分析和C/EBPβ作用靶基因的蛋白质水平筛选结果,我们挑选出C/EBPβ、CDKN1B、PKM2、RRP1B、RUNX2和MCM3六个蛋白形成目标蛋白群,调用595个模式蛋白在IPA数据库中的分子关系构建转录调控网络。转录调控网络分析结果表明,目标蛋白群各蛋白之间及与PI3K/AKT/mTOR信号通路所涉及蛋白存在密切的连接关系。围绕目标蛋白群优化设计的亚网络图进一步提示,在3T3-L1前脂肪细胞终末分化过程中C/EBPβ、 PIN1和PKM2可能存在调控关系,且与PI3K-AKT信号通路相关,有待于进一步研究验证。三、PKM2在3T3-L1前脂肪细胞分化MCE中的作用PKM2 (Pyruvate kinase M2)是一种糖酵解丙酮酸激酶同功酶。过去的研究证实PKM2在癌细胞中表达增加,是著名的Warburg效应中发挥关键作用的因素。在本课题中,PKM2被Triple TOFTM 5600和QSTAR XL两种质谱仪均检测出明显变化,在3T3-L1前脂肪细胞终末分化过程中符合持续升高的模式且变化显著,20小时含量是0小时的3.4倍。用Western Blott进行验证,结果一致。进一步进行RT-qPCR实验,结果表明在3T3-L1前脂肪细胞终末分化过程中PKM2的mRNA水平也明显上调。为了明确PKM2对3T3-L1前脂肪细胞完成MCE及终末分化的作用,我们采用RNA干扰技术抑制PKM2的表达,发现PKM2下调组的3T3-L1前脂肪细胞各时间点细胞数量和诱导20小时后进入S期的细胞比例明显低于对照组,且成脂能力明显下降。这一结果说明PKM2对于3T3-L1前脂肪细胞顺利完成MCE并进入脂肪细胞终末分化非常重要。ChIP-on-chip和基因表达谱芯片技术检测结果表明,PKM2是潜在的C/EBPβ作用的靶基因。为了进一步明确C/EBPβ对PKM2的表达是否具有调控作用,我们使用针对C/EBPβ的特异性siRNA (siC/EBPβ)来抑制C/EBPβ的表达,用RT-qPCR实验确定其干扰效果和对PKM2的mRNA表达水平的影响,并用Western Blot检测PKM2蛋白表达水平的变化。结果表明,当C/EBPβ表达下调时,3T3-L1前脂肪细胞的PKM2在mRNA水平及蛋白质水平均明显下调,且成脂能力明显下降。因此,在脂肪细胞分化过程中PKM2的表达水平受C/EBPβ调控,并与有丝分裂克隆扩增密切相关。