背景海洋生境中蕴含着丰富的具有特殊功能的微生物资源和酶资源。琼胶酶就是一类主要由海洋微生物产生的糖苷水解酶。由于琼胶酶可水解琼脂糖产生具有特殊生物活性的琼胶寡糖,使其在食品、医药、化妆品、日用化工和科学研究等领域极具应用潜力。而现有琼胶酶水解效率低、稳定性差,极大限制了其应用。目的为增加琼胶酶种类,丰富现有琼胶酶资源,本论文从海洋环境中分离纯化可培养细菌,筛选产琼胶酶菌株,采用基因组学和分泌组学相结合的方法最大化挖掘琼胶酶阳性菌株所产琼胶酶资源。方法1.选用4种海洋微生物培养基,分离、纯化黄海近岸海水、海藻样品的可培养细菌。通过16S rRNA基因序列分析确定候选新物种,多相分类学方法确定部分候选新物种的分类地位。使用卢戈氏碘液染色法及观察琼脂平板降解现象,筛选产琼胶酶菌株。2.采用基因组学和分泌组学相结合的方法挖掘产琼胶酶菌株D1326所产琼胶酶,并利用DNAMAN、DNAstar、SignalP-5.0 Server等生物信息学软件和服务器对琼胶酶编码基因序列进行分析,选取代表性的新型琼胶酶作进一步研究。3.运用分子生物学的技术手段实现新型琼胶酶Aga1459、Aga2820和Aga3584在大肠杆菌中的异源表达。并通过单因素实验和正交设计对基因工程菌株的产酶条件进行优化。4.利用镍柱亲和层析纯化带有组氨酸标签的融合蛋白rAga1459、rAga2820和rAga3584,并使用DNS法测定其酶活力,表征重组琼胶酶。结果1.共分离纯化海洋细菌143株,去重复后得到71株不同种类的纯培养海洋细菌,其中有6株是候选新物种。综合生理生化特征、化学分类特征、16S rRNA基因序列及基因组DNA序列的进化分析,确定了新物种Leucothrix sargassi C3212的分类地位。筛选到具有较强琼胶酶活性的菌株Agarivorans sp.D1326。2.对菌株D1326的基因组序列分析显示,该菌株含有9个琼胶酶的编码基因,综合生物信息学及分泌组的质谱分析结果,选取aga1459、aga2820和aga3584 3个基因作为研究对象。aga1459、aga2820和aga3584分别代表琼胶酶GH50、GH118和GH50家族的三种新型琼胶酶;其所编码的蛋白质理论分子量分别为110.0 kDa、47.7 kDa和31.7 kDa,氨基酸数量分别为996、447和309,除Aga2820外,其余两个基因所编码琼胶酶均有信号肽。3.成功构建基因工程菌株:1459-28a-BL(DE3)plyss、2820-28a-BL(DE3)plyss和3584-28a-BL(DE3)plyss。其最优发酵条件分别是:诱导温度20℃、诱导时间36 h、诱导时机3 h及IPTG浓度0.01 mM;诱导温度12℃、诱导时间30 h、诱导时机2 h及IPTG浓度0.015 mM;诱导温度16℃、诱导时间24 h、诱导时机1 h及IPTG浓度0.01 mM。4.成功纯化出电泳纯的琼胶酶:Aga1459、Aga2820和Aga3584。其最适反应温度分别是35℃、30℃和45℃,最适反应pH分别是6、9、6,Km和Vmax值分别是2.946 mg/mL和0.035 mg/min、10.585 mg/mL和0.084 mg/min以及30.273 mg/mL和0.423 mg/min。结论1.从黄海近岸海域获得了6株候选细菌新物种,确定了新物种Leucothrix sargassi C3212的分类地位,丰富了海洋细菌资源。2.成功获得了3个新型琼胶酶,分别归属于目前研究较少的GH50及GH118家族,极大丰富了琼胶酶资源库。