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目的通过对人Cystatin M(CST6)和反义Cathepsin B(CB)基因克隆和表达,观察CST6和反义CB单/双基因表达对乳腺癌细胞体外增殖、黏附、迁移及侵袭能力的影响,为进一步探讨CST6和反义CB抗乳腺癌作用机制提供理论依据。方法PCR一步法扩增CB目的片段,基因克隆技术构建pBudCE4.1-CB及pBudCE4.1-CB-CST6重组载体。PCR、酶切、测序方法筛选阳性重组质粒。脂质体法将单基因重组质粒和CST6及反义CB双基因共表达载体导入具有高侵袭性、高转移性的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231;Western-blot方法鉴定CST6和CB蛋白表达;噻唑兰比色(MTT)法和免疫组化Ki-67检测CST6和反义CB表达对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响;体外黏附实验检测其表达对MDA-MB-231细胞与基质(Matrigel)、纤维连接素(Fibronectin)黏附能力的影响;Transwell体外侵袭实验观察转染后肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化。结果1.应用基因克隆技术建立pBudCE4.1/CB重组载体和CST6及反义CB双基因共表达载体pBudCE4.1-CB-CST6,并瞬时转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231。2.体外增殖实验显示:单基因转染组MDA/CB和MDA/CST6细胞的增殖能力与空载体组、未转染组细胞相比明显下降(P＜0.01);同时双基因转染组MDA/CB-CST6细胞的增殖能力较MDA/CB和MDA/CST6细胞更进一步受到显著抑制(P＜0.01)。3.在黏附实验、Transwell侵袭运动实验中,与未转染组、空载体对照组相比,单基因转染组MDA/CB和MDA/CST6细胞与基质的黏附能力、体外侵袭能力和迁移能力均显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.01);运用pBudCE4.1-CB-CST6双基因共表达载体进行转染后,肿瘤细胞的基质黏附能力、迁移能力及体外侵袭能力均受到显著抑制,且抑制较单基因转染组MDA/CB和MDA/CST6细胞更为明显(P＜0.01)。结论首次建立CST6和反义CB单/双基因共表达载体。CST6和反义CB表达可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外增殖、黏附、迁移和侵袭,且所构建的双基因共表达载体表现协同抑制乳腺癌恶性生物学行为的作用,提示所构建的双基因共表达载体可作为一个候选的乳腺癌转移抑制载体,并有望为乳腺癌的基因治疗提供新的思路。