论文部分内容阅读
研究目的:筛选麻花秦艽抗缺氧作用有效部位,并对其抗缺氧有效部位作用机制进行初步研究。研究方法:1.采用过氧化氢（H2O2）、连二亚硫酸钠（Na2S2O4）、物理性缺氧（三气培养箱）三种方式分别建立PC12细胞缺氧模型,寻找三种方法最佳造模条件。2.麻花秦艽不同萃取部位处理PC12细胞24h,通过MTT法检测细胞活力,筛选不同部位用药的安全浓度范围。3.选取安全浓度范围内的麻花秦艽各萃取部位预处理PC12细胞24h,分别用H2O2、Na2S2O4、物理性缺氧三种方法进行缺氧处理,通过MTT法检测细胞活力,筛选麻花秦艽抗缺氧有效部位。4.小鼠灌胃给药15天后,采用低压氧舱模拟10000 m海拔缺氧环境,计算1h内小鼠存活率,筛选麻花秦艽抗缺氧有效部位。5.麻花秦艽有效部位预处理PC12细胞24h后,基于物理性缺氧模型损伤PC12细胞后,通过细胞形态学观察、MTT、LDH检测细胞活力,对麻花秦艽有效部位进行药效评价;Hoechst33258染色检测细胞凋亡;SOD、MDA等试剂盒检测氧化应激指标;qPCR、Westren Blot检测缺氧、炎症及凋亡相关基因及蛋白的表达水平,对麻花秦艽抗缺氧作用及机制进行初步研究。6.采用网络药理学对麻花秦艽有效部位抗缺氧作用化学成分及作用机制进行预测。研究结果:1.建立不同缺氧模型造模条件:H2O2缺氧损伤模型条件为:40μmol/L浓度H2O2,处理PC12细胞4h;Na2S2O4缺氧损伤模型条件为:2.5mmol/L浓度Na2S2O4,处理PC12细胞24h;物理性缺氧损伤模型条件为:94%N2、1%O2、5%CO2,处理PC12细胞48h。2.麻花秦艽不同部位药物安全浓度范围:乙酸乙酯部位0-600μg/mL,正丁醇部位0-200μg/mL,水相部位0-400μg/mL。综合各部位药物安全浓度范围研究结果,最终选取50、100、200μg/mL药物浓度进行麻花秦艽各部位抗缺氧药效筛选及有效部位抗缺氧药效评价研究。3.三种缺氧模型体外筛选麻花秦艽抗缺氧有效部位:麻花秦艽各部位均有一定抗缺氧作用,其中乙酸乙酯部位抗缺氧作用优于正丁醇和水相部位。4.通过10000m海拔小鼠急性缺氧耐力实验,筛选麻花秦艽抗缺氧有效部位,结果显示麻花秦艽各部位均具有一定的抗缺氧作用,其中乙酸乙酯部位作用优于正丁醇和水相部位。5.Hoechst33258染色显示麻花秦艽乙酸乙酯部位可明显减少缺氧PC12细胞凋亡,对缺氧PC12细胞具有一定的保护作用。qPCR结果显示,与模型组比较,药物组细胞Hif-1α、NF-κB mRNA表达水平明显降低（P<0.05）,Bcl-2/Bax比值水平有上升趋势（P>0.05）。Westren Blot结果显示,与模型组比较,乙酸乙酯部位药物组Bcl-2、Bcl-2/Bax比值水平明显升高（P<0.05）,Bax、Hif-1α、NF-κB等蛋白的表达水平明显下降（P<0.01、P<0.05）。6.采用网络药理学对麻花秦艽乙酸乙酯部位11个化学成分与缺氧相关靶点的网状关联进行了系统分析。其中C-T网络拓扑分析结果表明,11个化合物均具有较好的抗缺氧作用,其中山萘酚、木犀草素、熊果酸等可能为其抗缺氧的主要活性成分,PTGS2、MMP9为其抗缺氧的主要靶点。PPI网络拓扑分析结果表明,TP53、STAT3、AKT1等可能为乙酸乙酯部位抗缺氧的主要靶蛋白。KEGG通路分析结果表明,PI3K-Akt信号通路,Hif-1信号通路,TNF信号通路等为乙酸乙酯部位抗缺氧的主要通路。结论:麻花秦艽乙酸乙酯部位为其抗缺氧的有效部位,其抗缺氧作用可能通过提高缺氧细胞抗氧化能力、抗凋亡作用和影响Hif-1a/NF-κB通路等实现。