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目的探讨RNA干扰下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)表达对体外培养的活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)微管及微丝结合蛋白皮层肌动蛋白结合蛋白(cortical actin-binding protein,cortactin)和细丝蛋白A(filamin A)的影响。方法通过反复感染293T细胞,扩增携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)]并表达绿色荧光(green fluorescent protein,GFP)的重组腺病毒(Ad-sh RNA/PTEN)及只表达GFP的对照空病毒(Ad-GFP);体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,将腺病毒Ad-sh RNA/PTEN及空病毒Ad-GFP转染HSC-T6,应用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测HSC的PTEN m RNA及蛋白表达;采用免疫荧光法并利用激光扫描共聚焦显微镜技术检测HSC的α微管蛋白(α-tubulin)、γ微管蛋白(γ-tubulin)及微丝结合蛋白cortactin、filamin A表达,采用Image-pro plus 6.0图像分析软件进行图像分析,计算所测蛋白荧光表达的积分光密度值(integral optical density,IOD)。采用SPSS 17.0统计软件分析实验数据,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。实验分组:control组:DMEM代替腺病毒转染HSC;Ad-GFP组:以对照空病毒Ad-GFP转染HSC;Adsh RNA/PTEN组:以重组腺病毒Ad-sh RNA/PTEN转染HSC。结果1通过反复感染293T细胞获得实验所需滴度的重组腺病毒,Ad-GFP的滴度为1.6x108pfu/ml,Ad-sh RNA/PTEN滴度为1.4x108pfu/ml。2以感染倍数为100进行HSC腺病毒转染,48小时后荧光显微镜下计算转染效率均大于80%。3腺病毒感染HSC 48小时,采用实时荧光定量PCR检测各组HSC的PTEN m RNA表达,control组HSC的PTEN m RNA表达量设定为1,则Ad-GFP组、Adsh RNA/PTEN组HSC的PTEN m RNA表达量相对control组的倍数为0.92倍、0.64倍,Ad-sh RNA/PTEN组HSC的PTEN m RNA表达显著低于control组和Ad-GFP组(P<0.05),而control组和Ad-GFP组的肝星状细胞PTEN m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot技术检测3组HSC的PTEN蛋白表达,Adsh RNA/PTEN组HSC的PTEN蛋白表达(1.008±0.036)明显低于control组(1.438±0.038)及Ad-GFP组(1.413±0.058),P<0.05;而control组和Ad-GFP组肝星状细胞的PTEN蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。4免疫荧光法检测3组HSC的α-tubulin表达显示:α-tubulin主要表达于胞浆,Ad-GFP组和control组HSC的α-tubulin呈辐射状、丝网状均匀分布于细胞核周围,而Ad-sh RNA/PTEN组的α-tubulin向细胞两端的末梢逐渐聚集、微管稍增粗;Ad-sh RNA/PTEN组HSC的α-tubulin的荧光IOD(101495.17±5005.39)较control组(40803.00±2006.59)和Ad-GFP组(42302.50±2537.93)显著升高(P<0.05),而control组和Ad-GFP组之间HSC的α-tubulin荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05)。5免疫荧光法检测各组HSC的γ-tubulin表达显示:3组HSC的γ-tubulin均主要表达于胞浆内,并可见散在星点状凝集,但星点状凝集在Ad-sh RNA/PTEN组HSC更加明显,3组HSC的γ-tubulin亚细胞分布未见明显改变;Ad-sh RNA/PTEN组HSC的γ-tubulin荧光IOD(41310.83±1544.68)较control组(20410.68±1815.53)和Ad-GFP组(20137.50±1469.49)明显升高(P<0.05),而control组和Ad-GFP组之间HSC的γ-tubulin荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05)。6免疫荧光法检测各组HSC的cortactin表达显示:3组HSC的cortactin均主要表达于胞浆,且主要集中于皮质区,3组HSC的cortactin亚细胞分布未见明显改变;Ad-sh RNA/PTEN组HSC的cortactin荧光IOD(54688.50±2095.53)较control组(22959.94±1710.42)及Ad-GFP组(22547.11±1588.72)显著增强(P<0.05),而control组与Ad-GFP组之间HSC的cortactin荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05)。7免疫荧光法检测3组HSC的filamin A表达显示:3组HSC的filamin A荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05),但3组HSC的filamin A亚细胞分布发生了变化,control组和Ad-GFP组HSC的filamin A主要位于细胞核,而Ad-sh RNA/PTEN组HSC的filamin A主要分布于胞浆,Ad-sh RNA/PTEN组HSC的filamin A核浆比(0.69±0.06)较control组(1.13±0.03)和Ad-GFP组(1.12±0.04)显著下降(P<0.05);而control组与Ad-GFP组之间HSC的filamin A核浆比差异无统计学意义(P>0.05)。结论1 PTEN表达下调导致体外活化HSC的微管排列紊乱,聚合增强。2 PTEN表达下调明显增加了体外活化HSC的微管蛋白α-tubulin及γ-tubulin表达。3 PTEN表达下调可显著上调体外活化HSC的微丝结合蛋白cortactin表达。4 PTEN表达下调使体外活化HSC的微丝结合蛋白filamin A的亚细胞分布发生改变即出现胞核向胞浆转位。