【摘 要】
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乙烷基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)是一种高效基因诱变剂,利用ENU诱变技术,可获得大量与人类疾病相似的动物疾病模型用于与人类疾病相关的研究。通过ENU诱导小鼠突变的方法,本实验获得一例可遗传眼畸形杂合小鼠模型(主要表型为虹膜缺损及角膜混浊),并对该小鼠眼球进行组织学分析及突变基因的定位和鉴定。研究工作分为以下三个部分:1、ENU诱变获得一例眼畸形小鼠模型及其眼球组
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乙烷基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)是一种高效基因诱变剂,利用ENU诱变技术,可获得大量与人类疾病相似的动物疾病模型用于与人类疾病相关的研究。通过ENU诱导小鼠突变的方法,本实验获得一例可遗传眼畸形杂合小鼠模型(主要表型为虹膜缺损及角膜混浊),并对该小鼠眼球进行组织学分析及突变基因的定位和鉴定。研究工作分为以下三个部分:1、ENU诱变获得一例眼畸形小鼠模型及其眼球组织学分析采用ENU腹腔注射20只成年C57BL/6J(B6)雄鼠(G0),待其恢复生殖能力后分别与野生型B6雌鼠配种,获得G1代小鼠。经显性突变筛选和遗传实验,4例G1代小鼠的异常表型可以遗传。本文以G1代中一例可遗传的眼畸形小鼠为研究对象,将其与野生型B6小鼠配种,记录的120只后代小鼠中有56只后代小鼠出现虹膜缺损、角膜混浊或同时可见虹膜缺损及角膜混浊表型。筛选4周龄和8周龄角膜混浊表型的眼畸形小鼠使用同窝野生型小鼠为对照,进行组织学分析。HE染色发现:角膜混浊表型小鼠的角膜上皮细胞层出现明显空泡,角膜基质层胶原纤维排列杂乱松散且角膜内皮细胞部分脱落;采用免疫组织化学技术检测角膜混浊小鼠角膜上皮细胞K14、K12、K10的表达,结果发现:(1)4周龄和8周龄野生型小鼠角膜上皮K12表达于整个角膜上皮;K14表达于角膜上皮细胞的基底层,信号较弱;K10不表达;(2)与野生型小鼠相比,角膜混浊表型的小鼠角膜上皮在4周龄时K12表达无明显变化,8周龄时在角膜上皮空泡病变局部K12表达量明显减弱,K14表达在4周龄及8周龄时均表达增强;K10为阴性。2、眼畸形小鼠突变基因的染色体定位将B6背景的眼畸形小鼠与野生型C3He/J(C3)小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠回交野生型B6小鼠,获得[(B6×C3)F1×B6]N2代杂合子小鼠。利用微卫星标记及连锁分析法进行突变基因的染色体定位,结果显示:眼畸形小鼠的突变基因与微卫星D2Mit249连锁(LODs为3.19),故将该突变基因初步定位于2号染色体上。在初步定位的基础上扩大N2样品并继续筛选高密度的微卫星对其进行精确定位,最终将该小鼠的突变基因定位于小鼠2号染色体D2Mit107(距着丝粒65.13cM)与D2Mit423(距着丝粒73.57cM)之间。3、眼畸形小鼠突变基因的鉴定在定位区域内逐个查询并分析相关基因,结果发现有文献报道Jag1基因突变小鼠与本小鼠表型类似,故最终选出本突变的一个候选基因为Jag1基因。设计相应引物,对PCR或RT-PCR扩增产物进行胶回收后直接测序分析发现:从外显子25开始,突变杂合子RT-RCR产物测序信号图出现连续的重叠信号,考虑到可能存在mRNA剪接异常。将该RT-PCR产物进行T-A克隆后再次测序,并继续对外显子25及侧翼序列进行测序。结果发现:突变杂合子小鼠一条染色体上Jag1基因第24号内含子3’端AG碱基被GG碱基所替代,导致第25号外显子存在7个碱基的缺失。蛋白预测发现该突变使得Jag1编码区移码及蛋白质编码提前终止。结论:利用ENU诱变技术,本文获得一例可稳定遗传眼部畸形小鼠模型(主要表现为角膜混浊和虹膜缺损),并对角膜混浊小鼠眼球进行组织学病理特点分析。突变基因鉴定发现,此表型是由Jag1基因新的等位突变引起。本研究为该小鼠作为人类眼畸形疾病动物模型的应用奠定了基础。
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