伯氏疟原虫蛋白磷酸酶Pb.PP5相关生物学特性研究

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目的:疟疾(Malaria)是一种通过按蚊叮咬传播的虫媒传染病,可能导致严重并发症和死亡。目前全球有九十多个国家仍存在疟疾,约34亿人面临感染疟疾的风险。利用青蒿素联合疗法(ACTs)已经将死亡率大大降低,但东南亚已经出现了耐药虫株。传播阻断疫苗(TBVs)被认为可降低病原虫传播,但TBVs的研究充满了挑战,主要表现在蛋白免疫接种后诱导的抗体水平较低、免疫佐剂引起的不良反应一系列的问题。为了寻找更加有效的传播阻断,许多人开始关注与疟原虫分化、发育密切相关的分子生物学和免疫学等基础性研究。蛋白磷酸酶通过磷酸化信号分子,参与疟原虫生长发育的一系列复杂的信号分子传导通路。在疟原虫红内期分裂和对红细胞外信号刺激作出反应的过程中,通过磷酸化和去磷酸化机制改造核心的转录和翻译组件的能力对疟原虫存活至关重要。由此我们考虑蛋白磷酸酶是否会成为传播阻断疟原虫的新方向。本试验选择Pb.PP5作为目的基因,确定其表达阶段、生物功能及传播阻断的能力,为进一步研究疟原虫蛋白磷酸酶提供参考。  研究方法:运用生物信息学分析Pb.PP5的跨膜区,抗原决定簇及同源性等基本信息;利用酵母表达系统获得重组蛋白;免疫小鼠获得重组蛋白免疫血清;ELISA方法检测重组蛋白免疫原性;Western blot及IFA方法定位Pb.PP5蛋白;体外传播阻断实验检测Pb.PP5重组蛋白的阻断能力;利用双交叉同源重组方法获得Pb.PP5敲除虫株,并进行Pb.PP5基因功能性研究。  结果:1、预测了Pb.PP5的抗原决定簇及跨膜域.并与其他真核生物的同源性进行比对。2、成功获得免疫血清。3、免疫血清抗体效价对比对照组有明显升高。4、Western blot及IFA检测重组蛋白裂殖体、配子体、动合子三个阶段均有表达。5、与对照组相比,用免疫血清体外培养动合子,配子体出丝及动合子形成均减少。6、获得Pb.PP5敲除虫株。7、与野生株相比,Pb.PP5敲除虫株雌雄配子体比率和动合子形成率上显著下降。  结论:1、Western blot及间接免疫荧光显示Pb.PP5在裂殖体、配子体、动合子三个阶段均有表达。2、Pb.PP5对红内期疟原虫感染性和侵袭力没有影响。3、Pb.PP5对雄配子体出丝及动合子形成有一定影响。
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