背景和目的正畸牙槽骨改建的第一步是牙槽骨的吸收,成熟的破骨细胞(osteoclast,OC)是唯一行使骨吸收功能的细胞,OC的分化和成熟主要依赖于成骨细胞(osteoblasts, OB)的调控。OB通过与OC的细胞间连接以及分泌可溶性因子调控OC的分化和成熟,这些因子称为OC分化相关因子。机械力作用下,OB产生OC分化相关因子,通过多种途径和机制参与和调节OC的分化和功能。在目前发现的调节OC分化的细胞因子中,核转录因子kB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)是两个关键调节因子。此外,一些炎性细胞因子也具有重要的调节作用,如白细胞介素(interleukin, IL)-1, IL-6,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a等,能够直接或间接促进OC的分化和活化,又被称为骨吸收炎性因子。除了细胞因子,一些脂质作为信号传递分子,参与骨重建过程。其中,前列腺素(prostaglandin, PG)E2的作用非常显著,可促进OC分化和骨吸收,并调节炎症反应。在正畸牙移动的龈沟液中,PGE2的表达水平较高。本研究相关的前期实验发现,压力上调成骨细胞表达PGE2,进而上调RANKL、M-CSF的表达和下调骨保护蛋白(osteoprotegerin, OPG)的表达,从而诱导OC分化。IL-17是一种重要的促炎性细胞因子,1993年首次由活化的T细胞(TH17)克隆而来,直到近年来人们才对其有了一定的认识。IL-17结构独特,与其他已知的蛋白和白介素的结构没有相似性,在人类和鼠类的基因组包括至少6个成员(A-F)和5个受体成员(RA-RE).而功能方面,IL-17具有强大的促炎症作用和骨吸收的作用。近年来的研究发现,IL-17可促进IL-1,TNF-a的合成,诱导IL-6和IL-8在成纤维细胞内的表达。可增强OB内TNF-α、PGF2a诱导IL-6的合成作用,IL-17可上调多种细胞内RANKL的表达而促进OC的分化。作为最新发现的骨吸收炎性因子,IL-17在多种涉及骨丢失疾病中的重要作用不断被发现和深入研究,如牙周炎,风湿性关节炎,骨关节炎等。因此,我们设想IL-17参与正畸过程中的牙槽骨的吸收,通过OB促进OC的分化和功能。但是机械力作用下IL-17在OB内的表达情况,目前国内外尚无报道,而IL-17通过什么机制参与OC的分化过程,目前尚不清楚。因此,本研究通过检测压力作用下IL-17及其受体在OB内的表达；研究IL-17A调控OC分化相关因子在OB内的表达及其作用机制；检测IL-17调节OB诱导OC分化的作用,探讨IL-17在体外介导OB诱导OC的作用,为进一步阐明正畸牙移动和牙槽骨改建的分子生物学机制提供理论和实践依据。实验方法1.检测压力作用下,IL-17及其受体在OB内的表达情况.以来自新生小鼠颅骨的细胞系-MC3T3-E1细胞作为OB,用含10%FBS的a-MEM培养。按2.0 x 104 cells/cm2的密度将细胞接种于96孔板,用含50 mM磷酸甘油和50μg/ml抗坏血酸的培养液培养7-10天,茜素红染色观察矿化结节。按相同密度将细胞接种于100 mm培养皿,待细胞融合80%,换用含1%FBS的a-MEM培养液培养12h后,开始施加压力。按实验室以往研究,采用细胞均匀加力装置施加0、1.0、2.0或3.0g/cm2(0、98、196或294Pa)的压力,加力时间分别为1h、3h、6h、9h、12h或24h。活细胞计数试剂盒检测压力对细胞生长的影响,选择对细胞生长影响小的1.0和2.0g/cm2作为实验组。加力结束后,采用实时定量RT-PCR检测IL-17家族、IL-17受体家族、IL-lα、IL-6mRNA表达情况,采用细胞免疫荧光技术和ELISA方法检测加力9h后IL-17A蛋白表达情况。按相同密度将细胞接种于100 mm培养皿,待细胞融合80%,换用含1%FBS的a-MEM培养液培养12h后,加入0或10 ng/ml的IL-17A继续培养6h、24h或72h,实时定量RT-PCR检测IL-17受体mRNA表达情况。2.检测IL-17A调控OC分化相关因子在OB内表达的作用及机制。按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100 mm培养皿,待细胞融合80%,换用含1%FBS的a-MEM培养液培养12h。分别进行以下实验。(1)加入0、0.1、1或10ng/ml的IL-17A继续培养6h、12h、24h、48h或72h。实时定量RT-PCR检测RANKL、OPG、M-CSF、IL-lα、IL-6、TNF-α、COX-1和COX-2mRNA表达情况,ELISA方法检测PGE2、RANKL、OPG、M-CSF、IL-lα、IL-6和TNF-a蛋白表达情况。(2)加入0或1.5 ng/ml的PGE2继续培养24h。实时定量RT-PCR检测RANKL、OPG、M-CSF、IL-lα、IL-6和TNF-a mRNA表达情况。(3)加入0或10 ng/ml的IL-17A和／或10μ,M塞来昔布(COX-2抑制剂)继续培养24h或72h。ELISA方法检测PGE2、RANKL、OPG、M-CSF、IL-la、IL-6和TNF-α蛋白表达情况。3.检测IL-17A间接诱导破骨样细胞(osteoclast-like cells,OCL)分化的作用和机制。按2.0 x 104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100 mm培养皿,待细胞融合80%,加入0或10 ng／ml的IL-17A的含1%FBS的a-MEM继续培养72h。再换用含1%FBS的a-MEM培养12h,收集细胞培养上清。按照30%的比例与含10%FBS的a-MEM混合,加入50 ng/ml的RANKL,作为条件培养液。以鼠源性单核-巨噬细胞系RAW264.7作为破骨细胞前体,用含10%FBS的a-MEM培养,2天换液一次。按1.25 x 104 cells/cm2的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板,孵育24h后,换用条件培养液培养3,5,7或10天,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定和计数OCL。按1.25×104 cells/cm2的密度将RAW264.7细胞接种于6孔板,孵育24h后,换用条件培养液培养3,5,7或10天,实时定量RT-PCR和Western-blot方法分别检测组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶(MMP)-9和碳酸酐酶(CA) II mRNA和蛋白表达情况。按2.0 x 104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100 mm的培养皿,待细胞融合80%,加入的IL-17A (0或10 ng/ml)和／或10μM塞来昔布的含1%FBS的a-MEM继续培养72h。再换用含1%FBS的a-MEM培养12h,收集细胞培养上清。按照30%的比例与含10%FBS的a-MEM混合,加入50 ng/ml的RANKL,作为条件培养液。按1.25 x 104 cells/cm2的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板或6孔板,孵育24h后,换用条件培养液培养7天,TRAP染色鉴定和计数OCL,实时定量RT-PCR方法检测组织蛋白酶K、MMP-9和CAIImRNA表达情况。实验结果1.压力作用下,IL-17及其受体在OB内的表达情况。1.1压力作用下,IL-17家族mRNA在OB内的表达情况在一个加力周期内,对照组和实验组的IL-17(A-F) mRNA的表达逐渐升高,6h达到最高,9h后表达逐渐降低,IL-17A mRNA的表达水平在IL-17家族中最高。与对照组相比,IL-17A.IL-17D和IL-17E mRNA的表达在1.0和2.0g/cm2的压力加载后的3h,6h,9h,12h和24h均显著增强(P<0.05或P<0.01)；IL-17B.IL-17C和IL-17F mRNA的表达在1.0或2.0 g/cm2的压力加载后的6h,9h,12h和24h均显著增强(P<0.05或P<0.01)。在细胞加力后的初期和中期(3h,6h,9h),IL-17A-F mRNA的表达随着压力的增加而增强,但在细胞加力后的后期(12h,24h),IL-17A-F mRNA在1.0 g/cm2力值加载条件下比2.0g/cm2加载条件下的表达更多。1.2压力作用下,IL-17受体家族mRNA在OB内的表达情况在一个加力周期内,对照组和实验组的IL-17RA、IL-17RC和IL-17RD mRNA的表达逐渐升高,9h达到最高,12h后表达逐渐降低,IL-17RB和IL-17RE mRNA的表达逐渐升高,6h达到最高,9h后表达逐渐降低。IL-17RC mRNA的表达水平在IL-17受体家族中最高。与对照组相比,IL-17RA和IL-17RE mRNA的表达在1.0和2.0g/cm2的压力加载后的6h,9h,12h和24h均显著增强(P<0.05或P<O.01):IL-17RC和IL-17RD mRNA的表达在1.0或2.0 g/cm2的压力加载后的6h,9h和12h均显著增强(P<0.05或P<0.01)；IL-17RB mRNA的表达在1.0和2.0 g/cm2的压力加载后的3h,6h和9h均显著增强(P<0.05或P<0.01)。在细胞加力的初期和中期(3h,6h,9h),IL-17RA-RE mRNA的表达随着压力的增加而增强,但在细胞加力的后期(12h,24h),IL-17 RA-RE mRNA在1.0 g/cm2力值加载条件下比2.0g/cm2加载条件下的表达更多。1.3压力作用下,IL-17A蛋白在OB内的表达情况细胞加力9h后,对照组中未见IL-17A蛋白的表达；细胞加载1.0g/cm2压力的实验组,部分细胞的细胞质内呈现红色荧光,IL-17A蛋白水平为7.125 pg/ml,细胞加载2.0 g/cm2压力的实验组,部分细胞的细胞质内呈现红色荧光,IL-17A蛋白水平为9.019 pg/ml。表明随压力增加,IL-17A蛋白表达增加。1.4 IL-17A调节IL-17受体家族mRNA在OB内的表达情况IL-17A作用于成骨细胞后,与对照组相比,IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC和IL-17RE mRNA的表达均有显著增加(P<0.05),但IL-17RD的表达没有显著性差异。1.5压力作用下,IL-la和IL-6mRNA在OB内的表达情况在一个加力周期内,对照组和实验组的IL-1a和IL-6 mRNA的表达逐渐升高。与对照组相比,IL-1αmRNA的表达在1.0或2.0g/cm2的压力加载后的6h、9h、12h和24h均显著增强(P<0.01); IL-6 mRNA的表达在1.0或2.0 g/cm2的压力加载后的9h、12h和24h均显著增强(P<0.05或P<0.01)。2.IL-17A调控OC分化相关因子在OB内表达的作用及机制。2.1 IL-17A调节RANKL、OPG、M-CSFmRNA和蛋白在OB内的表达情况在IL-17A刺激作用下,与对照组相比,实验组的RANKL和M-CSF mRNA表达显著增加,OPG mRNA表达显著降低：RANKL mRNA表达在24h-72h增加了1.3-1.8倍(P<0.05或P<0.01),M-CSF mRNA表达在72h增加了1.6-1.9倍(P<0.01),OPG mRNA表达在48h-72h降低了0.8-0.9(P<0.05)。IL-17A刺激成骨细胞72h后,与对照组相比,实验组的RANKL和M-CSF蛋白表达显著增加,OPG蛋白表达显著降低：RANKL蛋白表达增加了1.9-2.4倍(P<O.05), M-CSF蛋白表达增加了1.2-1.4倍(P<0.05), OPG蛋白表达降低了0.7-0.8倍(P<0.05)。2.2 IL-17A调节骨吸收炎性因子mRNA和蛋白在OB内的表达情况对照组和实验组的IL-1αmRNA表达逐渐降低,直到48h；IL-6 mRNA表达逐渐升高到24h,48h后逐渐降低；TNF-a mRNA表达逐渐升高,直到72h。在IL-17A刺激作用下,与对照组相比,实验组的骨吸收炎性因子mRNA表达显著增加：IL-lαmRNA表达在6h-72h增加了1.3-4.3倍(P<0.05或P<0.01),IL-6mRNA表达在6h-72h增加了1.3-2.5倍(P<0.05或P<0.01),TNF-a mRNA表达在12h-72h增加了1.2-3.5倍(P<0.05或P<0.01)。IL-17A刺激OB的24h后,与对照组相比,实验组的骨吸收炎性因子蛋白表达显著增加：IL-1a蛋白表达显著增加了1.3-1.5倍(P<0.05或P<0.01),IL-6蛋白表达显著增加了2.1-2.6倍(P<0.01),IL-17A刺激OB的72h后,TNF-a蛋白表达显著增加了1.5倍(P<0.01)。2.3 IL-17A调节COX-1和COX-2 mRNA在OB内的表达情况对照组和实验组的COX-2 mRNA表达逐渐降低,直到48h。在IL-17A刺激作用下,与对照组相比,实验组COX-2mRNA表达在6h、12h和24h显著增加了1.2-2.4倍(P<0.01)。但COX-1的mRNA表达不受IL-17A的影响。2.4 IL-17A和／或celecoxib调节PGE2在OB内的表达情况在IL-17A刺激作用下,与对照组相比,实验组的PGE2蛋白表达显著增加,并呈剂量依赖性的特点：在6h,24h和72h分别增加了1.06-2.19倍,1.57-2.05倍和2.75-3.50倍。在IL-17A和celecoxib共同作用的24h, celecoxib阻滞了IL-17A对PGE2的刺激作用,PGE2蛋白含量显著降低,接近于对照组的水平。表明IL-17A是通过上调COX-2的表达而增加PGE2的表达。2.5 PGE2调节OC分化相关因子mRNA在OB内的表达情况在PGE2作用下,与对照组相比,实验组的RANKL和M-CSF的nRNA表达显著增加(P<0.01),OPG的mRNA表达显著降低(P<0.05)；实验组的IL-1a和IL-6的mRNA表达显著增加(P<0.01),但TNF-α的]mRNA表达无显著性差异。2.6 celecoxib对IL-17A调节OC分化相关因子蛋白在OB内表达的影响作用在IL-17A和celecoxib共同作用的72h后,celecoxib阻滞了IL-17A对RANKL、OPG和M-CSF的刺激作用,RANKL和M-CSF蛋白含量显著降低,OPG蛋白表达显著增加,接近于对照组的水平。在IL-17A和celecoxib共同作用24h后,celecoxib阻滞了IL-17A对IL-1a和IL-6的刺激作用, IL-1a和IL-6蛋白含量显著降低,接近于对照组的水平,IL-17A和celecoxib共同作用72h后,TNF-α的蛋白表达与对照组相比无显著性差异。3.IL-17A间接诱导oCL分化的作用。3.1 IL-17A诱导OCL形成的作用用IL-17A处理或未处理的条件培养液培养RAW264.7细胞的第3天,可见TRAP染色阳性的多核巨细胞(OCL)出现,第5天和第7天,细胞体积变大,数量增加,第10天,OCL逐渐减少。在第5天和第7天,与对照组相比,IL-17A处理的条件培养液诱导的OCL体积较大,数量显著增多,分别增加1.45倍和1.34倍(P<0.01)。3.2 IL-17A调节cathepsin K, MMP-9和CAⅡmRNA在OCL内的表达情况用IL-17A处理或未处理的条件培养液培养RAW264.7细胞的10天内,cathepsin K, MMP-9 mRNA的表达逐渐增加,CAⅡmRNA的表达没有明显变化,只在第10天轻微增加。与对照组相比,实验组的cathepsin K mRNA的表达在第5天和7天分别增加了1.50和1.40倍(P<0.05或P<0.01),实验组的MMP-9 mRNA的表达在第7天增加了1.31倍(P<0.01)。但实验组的CAⅡmRNA的表达没有明显变化。3.3 IL-17A调节cathepsin K, MMP-9和CAⅡ蛋白在OCL内的表达情况用IL-17A处理或未处理的条件培养液培养RAW264.7细胞的第10天,cathepsin K, MMP-9和CAⅡ蛋白表达与其mRNA表达相似。与对照组相比,实验组的cathepsin K的蛋白表达增加了1.35倍(P<0.01),实验组的MMP-9的蛋白表达增加了1.42倍(P<0.01)。而实验组的CAⅡ的蛋白表达没有明显变化。3.4 celecoxib对IL-17A诱导OCL形成的影响作用用IL-17A处理或未处理的条件培养液培养RAW264.7细胞的第7天,与对照组相比,IL-17A处理的条件培养液诱导的OCL体积较大,数量显著增多(P<0.01)。用IL-17A和celecoxib处理的条件培养液培养RAW264.7,OCL数量显著下降,接近于对照组的水平。celecoxib阻滞了lL-17A对OCL的间接诱导作用。3.5 celecoxib对IL-17A调节cathepsin K和MMP-9 mRNA表达的影响作用用IL-17A和celecoxib处理的条件培养液培养RAW264.7, cathepsin K和MMP-9mRNA显著下降(P<0.05),接近于对照组的水平。表明COX-2抑制剂阻滞了IL-17A对cathepsin K和MMP-9 mRNA表达的上调作用。结论1.成骨细胞MC3T3-E1可在mRNA水平表达6个IL-17家族成员(IL-17A-F)和5个受体家族成员(IL-17RA-RE),并在蛋白水平表达IL-17A,因此,成骨细胞也可产生IL-17。2.压力诱导IL-la, IL-6, IL-17及其受体的mRNA和IL-17A蛋白在成骨细胞内的表达增强,而且IL-17A在其家族成员中的表达水平最高。提示IL-17可能参与机械力诱导的牙槽骨吸收过程。3.IL-17A显著上调RANKL和M-CSF,下调OPG的mRNA和蛋白在成骨细胞内的表达：IL-17A显著上调IL-1α, IL-6和TNF-a的mRNA和蛋白在成骨细胞内的表达,证实IL-17A在体外调控成骨细胞内的破骨细胞分化相关因子的表达。4.IL-17A通过上调COX-2/PGE2的表达(可被celecoxib沮滞),从而调控破骨细胞分化相关因子在成骨细胞内的表达,揭示了该调控作用的机制。5.IL-17A促进成骨细胞诱导破骨样细胞的分化,并上调cathepsin K, MMP-91的mRNA和蛋白在破骨样细胞中的表达,证实IL-17在体外促进成骨细胞诱导破骨样细胞的分化和功能。6.IL-17A通过上调成骨细胞内COX-2/PGE2的表达(可被celecoxib阻滞),调控破骨细胞分化相关因子的表达,从而促进成骨细胞诱导破骨样细胞的分化和功能,揭示了IL-17在体外促进成骨细胞诱导破骨样细胞的分化相关的机制。7.本研究探讨了IL-17在体外介导成骨细胞诱导破骨样细胞分化的作用,为进一步阐明正畸牙移动和牙槽骨改建的分子生物学机制提供理论和实践依据。