一、研究背景和目的肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属的成员,归属于人类肠道病毒A。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病,严重病理症状通常在儿童中发生。自1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病(1969-1973年)的患者中分离到EV71,随后,世界上许多国家相继报道了EV71病毒在不同地区的流行情况,EV71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行。尽管EV71的基因组和生命周期相似于小核糖核酸病毒科的其它成员,但相应引起的病理症状明显不同；至今尚无特异性的治疗方法及有效的针对性的疫苗预防EV71的感染,因此明确EV71的致病机制对控制婴幼儿手足口病的流行与有效治疗该疾病具有十分重要的意义。相关研究证实在EV71患者中枢神经系统(central nervous system, CNS)的脑干、神经元等部位都已检测到EV71基因及抗原的存在,证明EV71能进入CNS。目前,对于EV71进入CNS的途径有两种理论,如同脊髓灰质炎：病毒入血穿血脑屏障或通过末梢神经沿逆轴突运输感染CNS。有关研究证实新生小鼠口服EV71后,早期可引起持续性病毒血症和血脑脊液屏障通透性增加,推测EV71可通过血运途径传播,但脑组织低水平的病毒数量提示血源性途径并非累及CNS的主要途径,所以EV71穿血脑屏障(blood brain barrier, BBB)机制还未明确。众所周知,BBB是循环和CNS之间一道主要的屏障,它限制着不同物质在两个部位之间的自由运输,对维持CNS的体内平衡起着一个关键的角色,故明确EV71穿BBB的机制对于防治EV71所致的CNS感染有重要意义,这亦是我们想探讨的内容。我们知道,病毒感染过程的第一步是病毒通过与位于细胞表面的特异性受体结合而吸附于被感染的细胞的表面,然后利用细胞的内吞作用进入细胞或将病毒的核酸释放进细胞。所以我们推测构成BBB的主要成分之一内皮细胞可能是EV71的易感细胞,EV71与其结合而导致BBB结构改变和功能障碍,从而感染中枢神经系统。本研究采用分离鉴定的来自于重症手足口病患者的EV71毒株感染HBMEC,形态学观察HBMEC的细胞病变、透射电镜检测HBMEC中EV71的超微结构与Real-Time PCR方法以检测HBMEC细胞培养上清液中EV71拷贝数变化情况,以探讨EV71是否能感染HBMEC并能在其中复制；且进一步检测EV71是否可以诱导HBMEC细胞骨架的改变并诱导其凋亡。最后,因为病毒成功实现对宿主细胞的感染并在细胞内复制需要克服细胞对病毒感染产生的各种免疫防卫反应,阻断或影响宿主细胞的正常循环机制,利用宿主细胞的物质和能量合成病毒自身物质,这种相互作用最终会导致宿主细胞蛋白表达模式的改变,这种改变影响着宿主细胞的正常生理功能,决定和反映着病毒感染致病的进程和结果。为了研究EV71感染HBMEC后宿主细胞蛋白表达模式的改变,为揭示病毒与HBMEC的相互作用机制、病毒的分子致病机制、寻找病毒的作用靶标等研究提供有意义的信息。本研究采用2-D技术分析HBMEC感染EV71后1h、16h、24h时间点与正常HBMEC的培养上清和细胞内的蛋白表达差异点,然后对差异蛋白点进行酶切,提取肽片段,最后用MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术获得PMF MSMS图,并利用Internet上的蛋白质数据库对肽质量进行检索,寻找具有相似肽质量指纹图的蛋白质,鉴定了差异率>2.5的蛋白。并采用免疫印迹方法进一步对其中波形蛋白(vimentin)差异蛋白的变化进行了验证。二、方法1、分离与鉴定来自于临床诊断为重症手足口病患者的EV71毒株采用来自于临床诊断为重症手足口病患者的粪便或肛拭子,经肠道病毒通用型引物及EV71特异性引物检测初步诊断为EV71感染。再经RD细胞分离增殖病毒,并采用EV71(226bp)引物与EV71VP1全基因序列(1086bp)引物进行RT-PCR再次鉴定,并测序与blast比对证实。2、EV71对人脑微血管内皮细胞的感染采用已分离鉴定的EV71毒株感染HBMEC并设置空白对照组：观察HBMEC感染EV71后不同时间点的形态改变,并采用兔抗-EV71多克隆抗体检测HBMEC内EV71抗原的存在,透射电镜直接观察EV71作用HBMEC内是否存在EV71病毒颗粒,并采用(226bp)EV71特异性引物对EV71感染HBMEC和RD细胞不同时间点的培养上清液行定量Real-Time PCR,以检测HBMEC和RD细胞感染EV71不同时间点分泌的EV71拷贝数变化以得出EV71在HBMEC的复制趋势图。3、采用Jc-1线粒体早期凋亡试剂盒检测EV71感染HBMEC8h时能否导致HBMEC的早期线粒体膜电位降低；采用Annexin-V FITC/PI kit检测EV71能否导致HBMEC的凋亡；采用罗丹明-鬼笔环肽染色以探讨EV71感染HBMEC能否导致HBMEC细胞骨架的重排。4、EV71感染HBMEC差异蛋白质组学的研究采用分离EV71毒株在不同时间点感染HBMEC,收集裂解细胞,采用Bradford染色液定量蛋白,一向等电聚焦,二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并进行银染和考染,银染胶用来分析、考染胶进行质谱鉴定。采用ImageScanner扫描仪对胶进行扫描,凝胶图像用ImageMaster7.0进行分析。设置差异点倍数为2.5倍，对差异点进行确认，剔除单块胶个别丰度过高或低的点。挖取差异点进行酶切，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和蛋白信息数据库建立差异蛋白质谱。并对鉴定出的蛋白进行功能分析,并采用免疫印迹技术进一步验证鉴定出的差异蛋白vimentin在HBMEC感染EV71不同时间点及正常HBMEC中的表达。三、统计分析数据均用均数±标准差表示,采用SPSS13.0进行统计分析。不同时间点的凋亡率以及HBMEC与RD细胞两组间的EV71拷贝数比较采用两个重复测量因素的方差分析,线粒体凋亡采用独立样本t检验分析。P<0.05认为有统计学意义,相关统计图采用Excel或Origin绘图软件制作四、结果1、分离鉴定出一株重症EV71毒株。2、从形态学观察,EV71可以导致HBMEC的细胞病变,随着感染时间延长,病变程度愈严重；通过透射电镜可以发现EV71处理HBMEC内存在直径20-30nm的病毒颗粒；采用抗EV71多克隆抗体进一步证实EV71组HBMEC内EV71抗原的存在；而采用EV71特异性引物行实时荧光定量PCR表明EV71能感染HBMEC,并且可在HBMEC内复制,其拷贝数在感染第3天达到最高峰,其复制最高峰出现时间比EV71易感细胞RD细胞早,但最终拷贝数低于RD细胞(P<0.01)；通过采用罗丹明-鬼笔环肽染色证实EV71感染HBMEC能导致HBMEC细胞骨架的重排；另外采用JC-1试剂盒证实EV71能在8h诱导HBMEC早期凋亡；采用annexin-V FITC/PI凋亡检测试剂盒检测到EV71能诱导HBMEC的凋亡,而随着感染时间的延长,主要以细胞坏死为主,感染时间对EV71感染所诱导的凋亡和坏死有显著影响(P<0.01)。3、通过双向凝胶电泳与质谱鉴定,初步鉴定了HBMEC感染EV71在0、1、16、24h的28个差异表达蛋白。4、通过免疫印迹对EV71感染HBMEC与HBMEC的差异表达蛋白进一步验证,证实EV71感染HBMEC可以诱导Vimentin的表达下调,与蛋白质组学结果一致。五、结论1、我们分离鉴定了来自于重症手足口病患者的EV71野生毒株,体外模拟EV71感染HBMEC模型。2、通过形态学观察及免疫荧光和透射电镜方法证实EV71能感染HBMEC;采用Real-time PCR方法进一步证实EV71能在HBMEC内复制,这说明HBMEC是EV71的易感细胞,但复制效率低于RD细胞。HBMEC上可能存在EV71的特异性受体,EV71与BBB内皮细胞上特异性受体结合进而通过内吞作用进入细胞里面复制,导致其形态与功能改变而穿BBB入脑。3、采用JC-1线粒体凋亡检测试剂盒证实EV71感染HBMEC能诱导其线粒体膜电位降低,并且采用Annex-V FITC/PI染色方法证实EV71能诱导HBMEC的凋亡,随着感染时间延长,细胞主要以坏死为主。说明EV71可诱导HBMEC线粒体的凋亡,而线粒体结构和功能障碍是各种刺激因素诱导细胞凋亡的中心事件,并由此导致线粒体内凋亡诱发因子的释放,参与对细胞凋亡的调控,而引起了HBMEC的凋亡。4、EV71感染HBMEC能导致HBMEC细胞微丝结构的重排,而微丝结构的改变可能对于病毒的复制和活化也起到一定的辅助作用。5、蛋白质组学研究共发现EV71感染HBMEC进程中28个差异表达蛋白,按功能分为9类。结合差异谱中表达量发生改变的蛋白的功能与EV71感染和未感染HBMEC蛋白表达量变化分析,发现了一些在感染中有重要意义的分子靶标。6、Vimentin差异表达蛋白可能在EV71感染HBMEC事件中起着一定的作用。