骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种以关节软骨退行性变为主要病理特征的慢性关节疾病,常引起关节疼痛甚至残疾,严重影响患者生活质量,给社会和家庭带来巨大经济负担。然而,迄今有关OA的病因及发病机制仍不清楚。传统观点认为,OA为老年退行性疾病。其发病与年龄、性别、创伤、机械摩擦、职业、体重及运动量等因素有关。近来研究显示,OA与代谢综合征（metabolic syndrome, MS）关系密切。MS是高血压、高血糖、血脂紊乱和肥胖等多种疾病在体内集结的一种状态。英国学者Barker基于大规模流行病学调查结果发现,宫内生长迟缓（intrauterine growth retardation, IUGR）患儿成年后MS的发病率增加,并提出“成人疾病发育起源”假说。尽管OA与MS、MS与IUGR之间的相关性研究报道日益剧增,但至今OA与IUGR间直接联系的研究报道甚少。一项人群大样本纵向研究表明,男性低出生体重者发生手部OA的比例明显较高于对照组,女性也有类似的趋势。提示,OA与MS一样存在胎儿起源。乙醇（ethanol）是人类日常生活常用饮料。孕期饮酒是引起胎儿发育毒性的确切诱因。大量研究已表明,孕期乙醇暴露（prenatal ethanol exposure, PEE）可增加IUGR、胎儿神经管缺损以及胎儿酒精综合征的发生风险。据估计,全球每1000名新生儿中就有1-1.5名受母亲孕期饮酒的影响。人和动物研究表明：PEE胎儿在胎儿期及幼年期存在明显的生长迟滞,部分研究还指出这种生长迟缓可延续至成年。PEE是较为常用的诱导IUGR发生的实验动物模型,可导致子代一系列发育异常,可给个体内分泌和代谢功能带来长期的影响。本室和其他实验室结果均表明,PEE可导致子代IUGR和母源性糖皮质激素（glucocorticoid, GC）过暴露关节软骨是OA病理改变的核心组织,其质量与OA的发病息息相关。研究表明,关节软骨主要于出生前后发育期形成,关节软骨的发育不良可能促进OA的发生。正常情况下,关节软骨主要由唯一细胞成分软骨细胞合成和分泌其细胞外基质,以维持其生理功能；其中糖胺蛋白聚糖（aggrecan）和Ⅱ型胶原（ColⅡ）为其主要细胞外基质。转化生长因子β （transforming growth factor-β, TGFβ）信号通路的在关节软骨形成、生长发育、成熟及表型维持的整个组织生命过程中都扮演着重要的角色。TGFβ-Smad2/3-Sox9对软骨细胞增殖和细胞外基质合成起主要调控作用。研究表明,GC过暴露可导致软骨细胞增殖下降、基质合成减少、关节软骨变薄并导致软骨外基质含量下降,其机制可能为过高的GC抑制了胎鼠软骨细胞增殖和其TGFβ信号通路；细胞实验证实,过高的GC水平可抑制成骨细胞TGFβR的表达。如上所述,OA是否具有宫内起源,且其易感性是否具有普遍性?IUGR仔鼠成年OA易感性是否源于宫内软骨发育不良?PEE所致母源性GC过暴露是否会抑制IUGR仔鼠关节软骨局部TGFβ信号通路表达?IUGR仔鼠软骨发育不良是否与关节软骨局部TGFβ信号通路表达抑制有关?这些宫内改变是源于母源性GC的间接作用还是乙醇的直接作用?这些科学问题至今尚未见阐明。为此,本题拟进行如下工作：①利用三种OA诱导模型证实,PEE所致IUGR仔鼠成年后OA易感性增加；②整体水平观察PEE所致IUGR仔鼠关节软骨不同时期（孕20天,出生后2、6、12周）发育情况,并探讨其TGFβ信号通路抑制的分子机制；③皮质酮（corticosterone, CORT）处理三维培养大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）,模拟整体高GC对间充质干细胞向软骨细胞分化的影响,并从GR/CEBPa调控TGFβ信号通路角度探讨其可能机制。④利用乙醇处理三维培养大鼠BMSCs,探讨乙醇是否可能对BMSCs向软骨分化有直接影响。本课题的实施有利于全面认识OA与IUGR的关系,及其具体机制；为做到OA的早期预防和治疗提供一定理论依据和实验基础。第一部分孕期乙醇暴露所致IUGR子代大鼠成年后骨关节炎易感目的：在整体动物水平,利用三种OA模型证实PEE所致IUGR仔鼠成年后OA易感性增加。方法：Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和乙醇组。从孕9天（gestational day 9, GD9）起,乙醇组给予乙醇（4g/kg·d）暴露灌胃,对照组给予等体积生理盐水,直至孕鼠自然生产。出生后第一周（postal week 1,PW1）,保留每窝仔鼠数在8-15只的新生鼠,四周断奶。跑步模型：正常饮食喂养至成年,P，18给予长距离跑步（每日以20 m/min的速度跑55 min,共6周,总跑步里程30 Km）诱导OA。高脂饮食模型：断奶后即持续给予高脂饮食,含89.5%玉米粉、10%猪油和0.5%胆固醇的高脂饮食（其中含18.9%kcal蛋白质、61.7%kcal碳水化合物和19.4% kcal脂肪）至PW24,记录每4周体重及体重增长率。关节腔木瓜蛋白酶注射模型：自PW8开始对照组和PEE组大鼠分别于第1、4、7、10和13日经左膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液100μl；而右膝同时注射等量生理盐水。上述三模型造模结束后,异氟醚麻醉处死大鼠。跑步模型和木瓜蛋白酶注射模型取部分膝关软骨节行墨汁染色,观察大体形态改变；三种模型剩余膝关节行组织固定、包埋、脱钙切片后,行番红O-固绿染色,和/或HE染色,和/或甲苯胺蓝染色及Col2a1的免疫组化,光镜下观察软骨病理改变,并行OA的Mankin’s评分。结果：①体重、IUGR率：通过在高脂饮食模型中分析发现,与对照组相比,PEE可致出生体重显著降低,而IUGR率明显增高；在断奶后给予高脂饮食可出现追赶性生长,其绝对体重最终与对照无显著差别。②大体及显微镜下观测发现：与对照组相比,PEE组仔鼠成年后未接受跑步或木瓜蛋白酶刺激时,其关节软骨大体形态较对照组无明显改变；接受跑步或木瓜蛋白酶刺激后,其关节软骨行墨汁染色出现肉眼可见的软骨表面尤其是胫骨平台软骨表面严重磨损,关节软骨表面失去光泽并毛糙；③关节软骨病理学改变及评分：分别接受三种方式造模OA后,行大鼠胫骨平台番红O-固绿染色发现,对照组出现软骨基质轻度淡染,表面出现轻度毛糙；与对照组相比,PEE组出现不同程度的软骨表面缺损,软骨基质结构紊乱,软骨厚度变薄,基质淡染,软骨细胞数明显减少和潮线前移。三种模型中,PPE组Mankin’s评分均较相应的对照组显著增高（均P<0.01）。④分别对三种OA模型胫骨平台关节软骨细胞外基质Col2al行免疫组化分析发现,无刺激前,PEE组较对照无明显差异,而在接受刺激后,PEE组Col2a1免疫组化着色较相应的对照组减少,其OD值显著低于相应的对照组（P<0.05,P<0.01）。结论：PEE可引起IUGR,且这种IUGR仔鼠在出生后接受不同刺激造模OA后其膝关节出现典型的OA病理改变,提示,PEE子代大鼠成年后存在OA易感现象。第二部分孕期乙醇暴露所致IUGR子代大鼠关节软骨持续发育不良及宫内编程机制目的：在整体动物水平,观察PEE所致IUGR仔鼠出生前后关节软骨发育质量的动态变化情况,并探讨其TGFβ信号通路宫内低功能编程机制。方法：Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和乙醇组（PEE组）。从孕9天（gestational day 9, GD9）起,乙醇组给予乙醇（4g/kg·d）灌胃,对照组给予等体积生理盐水。一批孕鼠于GD20麻醉处死,剖腹取出胎鼠,并记录性别和体重,计算IUGR发生率。留取胎血和膝关节标本,ELISA法检测血清CORT浓度,部分胎鼠膝关节标本固定包埋,一部分获取关节软骨用于提取RNA。一批孕鼠自然生产,分别于出生后2、6、12周麻醉处死仔鼠,仔鼠左下肢进行固定、包埋,右下肢切取关节软骨用于提取RNA。固定包埋的标本进行切片行番红O-固绿染色和ColⅡ免疫组化分析；提取RNA的标本利用RT-PCR检测GR/CEBP, TGFβ通路中TGFβ1、TGFβR Ⅰ、Smad2/3、SOX9,细胞外基质Col2a1和Aggrecan各基因mRNA。结果：①体重、IUGR率和血CORT水平：与对照组相比,PEE胎鼠体重明显下降,下降至对照组的81.8%（P<0.01）, IUGR率升高至对照组的71.1%（P<0.01）。同时,PEE胎儿血中CORT浓度显著升高（P<0.01）；②关节软骨基质合成功能：与对照组相比,PEE仔鼠在GD20、及PW2、PW6、PW12各时间点其关节软骨区番红O染色减弱,光密度分析其GAG含量显示显著降低（P<0.05）；仔鼠关节软骨厚度变薄,细胞排列紊乱且数量减少；Col2a1免疫组化染色变浅,光密度分析其含量减少（P<0.05,P<0.01）；Col2a1和Aggrecan的mRNA表达在各时间均较对照低或成降低趋势（P<0.05,P<0.01）；③软骨TGFβ信号通路表达：与对照组相比,孕20天时,PEE胎鼠软骨局部GR/CEBPa表达显著增加（P<0.05,P<0.01）；而在出生后2、6、12周各时间点两者的表达无明显改变或呈降低趋势。然而,胎关节软骨局部TGFβ1、TGFβR Ⅰ、Smad2/3和SOX9的mRNA表达在GD20、及PW2、PW6、PW12各时间点显著降低或呈降低趋势（P<0.05,P<0.01）。结论：PEE可引起IUGR胎鼠关节软骨结构和功能发育不良,且这种结构和功能的不良可持续至出生后,其发生机制可能与孕期乙醇暴露所致母源性GC过暴露通过GR/CEBPa抑制胎关节软骨局部TGFβ信号通路,并致其出现宫内低功能编程改变有关。第三部分皮质酮所致骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化不良及其分子机制目的：利用三维培养BMSCs向软骨细胞分化模型,探讨胎软骨细胞发育不良的病因学,证实CORT对干细胞向软骨分化过程中TGFβ信号通路及基质合成功能的影响,并探讨其分子机制。方法：提取Wistar大鼠原代BMSCs。传代至第3代后,进一步以海藻酸钠微球作为生物支架进行第4代BMSCs三维培养并诱导其成软骨分化,并加入诱导因子脯氨酸、地塞米松、维生素C、TGF-1和TGF-3等环境下进行诱导分化。在定向诱导分化过程中,给予皮质酮（0、125、250、500、100ng/ml）处理。每天更换新鲜的培养液。正常对照组给予等体积培养基。在分化28天收获细胞,检测细胞增殖、细胞形态和软骨分化的标志基因、TGFβ通路相关基因表达的变化。在分化28天收获细胞,检测细胞增殖、细胞形态和软骨分化的标志基因、TGFP通路相关基因表达的变化。结果：①细胞毒性：不同浓度皮质酮作用BMSCs细胞,在BMSCs成软骨诱导培养28d后,MTT法细胞代谢活力检测结果显示皮质酮组细胞代谢活力与对照组相比没有明显改变。②细胞分化形态：而各浓度皮质酮处理组中,细胞数目较对照明显减少,尤以500和1000ng/ml皮质酮处理组明显,无细胞的空白区多于对照；细胞体积较小、多成幼稚细胞状,呈分化迟滞状。③TGFβ信号通路和细胞外基质表达：与对照组相比,CORT处理组细胞GR和CEBPa表达增高,而TGFβ、TGFβR Ⅰ、Smad2、Smad3、SOX9、Aggrecan和Col2a1的mRNA表达皆呈浓度依赖性降低（P<0.05,P<0.01）；米非司酮5 μM处理BMSCs5天后,其GR表达降低,而TGFβR Ⅰ和Smad2/3表达出现逆转性升高（P<0.05,P<0.01）；结论：CORT可通过GR/CEBPα系统抑制三维培养BMSCs中TGFβ信号通路的表达,导致成软骨相关的基因表达降低,最终致BMSCs向软骨分化迟滞,形成不良。第四部分乙醇致骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化不良及其分子机制目的：利用三维培养BMSCs向软骨细胞分化模型,探讨乙醇是否对胎软骨细胞发育产生直接作用,证实乙醇对干细胞向软骨分化可能存在直接作用,并探讨其分子机制。方法：提取Wistar大鼠原代BMSCs。传代至第3代后,进一步以海藻酸钠微球作为生物支架进行第4代BMSCs三维培养并诱导其成软骨分化,并加入诱导因子脯氨酸、地塞米松、维生素C、TGF-1和TGF-3等环境下进行诱导分化。在定向诱导分化过程中,给予乙醇（0.8、4、20、10 mM）处理。每天更换新鲜的培养液。正常对照组给予等体积培养基。在分化28天收获细胞,检测细胞增殖、细胞形态和软骨分化的标志基因、TGFβ通路相关基因表达的变化。结果：①细胞毒性：不同浓度乙醇作用BMSCs细胞,在BMSCs成软骨诱导培养28d后,MTT法细胞代谢活力检测结果显示乙醇组细胞代谢活力与对照组相比没有明显改变。②细胞分化形态：而各浓度乙醇处理组中,细胞数目较对照明显减少尤以20和100 mM浓度乙醇处理组明显,无细胞的空白区多于对照：细胞体积较小、多成幼稚细胞状,呈分化迟滞状。③TGFβ信号通路和细胞外基质表达：与对照组相比,乙醇处理组细胞GR和CEBPα表达改变不明显或成降低趋势,而TGFβ、TGFβRⅠ、Smad2、Smad3、SOX9、Aggrecan和Col2a1的mRNA表达皆呈浓度依赖性降低（P<0.05,P<0.01）；此外,乙醇处理组细胞的EGR1mRNA表达增高,而11β-HSD2表达出现降低（P<0.05,P<0.01）；结论：乙醇可通过激活cAMP/PKA/Egr-1通路而抑制11β-HSD2的表达,减弱细胞局部对GC的屏障作用,而加剧GC对细胞的作用,同时乙醇也可直接抑制BMSCs的TGFβ信号通路表达,最终致BMSCs向软骨分化迟滞,形成不良。