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猪细环病毒（Torque teno sus viruses, TTSuV）和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV2）在猪群中广泛分布。近年来研究表明，TTSuVs与PCV2混合感染率较高。PCV2能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）等猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease, PCVAD）。关于TTSuVs分子生物学研究甚少，本研究开展了TTSuVs遗传变异分析、抗原表位鉴定、感染性分子克隆构建、拯救毒株动物感染试验及病毒结构蛋白启动子等研究；此外还对PCV2衣壳蛋白（Capsid, Cap）中和抗原表位的关键氨基酸进行了解析。本研究旨在了解TTSuVs和PCV2的分子生物特性，为这两种病毒的协同感染致病性提供科学依据。TTSuVs是一种单股负链环状DNA病毒，临床流行的毒株间存在较大的基因差异，为了阐明该病毒在我国猪群中的遗传变异情况，本研究从临床送检的病料中，采用高保真PCR法扩增TTSuV1和TTSuV2基因组，将基因组克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒，重组质粒酶切鉴定后测序。共获得8株TTSuV1和8株TTSuV2全基因组序列，长度约2.9kb；将获得的序列与GenBank下载的29株TTSuV1和40株TTSuV2基因组序列进行了对比，绘制了系统发育进化树。结果表明，TTSuV1被分为4个基因亚群；其中TTSuV1a亚群毒株间基因序列同源性为87.5～95.2%，TTSuV1b亚群毒株间基因序列同源性为83.8～99.9%，TTSuV1c亚群毒株间序列同源性为80.3～97.6%，TTSuV1d亚群仅有2个毒株序列，均来自国内。TTSuV2被分为4个基因亚型，其中TTSuV2a、TTSuV2b和TTSuV2d亚群中毒株间基因序列同源性均为86.7～99.7%，TTSuV2c亚群中仅含2个毒株序列，均来自国内。TTSuV1d、TTSuV2c和TTSuV2d这3个亚群是我国猪群中的特有毒株。本研究表明TTSuVs不同基因亚群毒株间有较高变异性。TTSuV1ORF1编码Cap蛋白，其诱导机体产生的抗体具有免疫保护作用。在遗传变异分析基础上，Liu等（2013）制备了针对TTSuV1-c亚群流行毒株的8株抗TTSuV1Cap蛋白的单克隆抗体（Monoclonal antibody, mAb）。本研究通过原核截短表达的Cap蛋白和合成肽扫描技术方法，对这些mAb对应的抗原表位进行了鉴定。结果表明，有7株单抗针对于同一个Cap抗原表位，其核心序列为536HPKYAGQGGGYTT548；另1株单抗（1E9）识别的抗原表位核心区序列为549EIGHQGITAASLR561。有趣的是，这2个抗原表位是毗邻的，但彼此独立。以含有抗原表位的C-3多肽作为包被抗原，建立了一种间接ELISA方法，用于检测临床猪血清中TTSuV1抗体。用该方法对临床送检200份猪血清样品检测结果表明，TTSuV1抗体阳性率达81.0%，表明该病毒在我国猪群中广泛流行，为进一步开展该病毒的流行病学调查提供了技术手段。为了寻找适合TTSuV1体外培养增殖的细胞系，以期获得TTSuV1纯毒株，本研究以克隆的TTSuV1-SY基因组为骨架，基因组内插入1个外源的Sal I酶切位点，经酶切再环化后借助脂质体试剂转染ST和PK-15等细胞。对拯救克隆毒株鉴定结果显示，转染后48h能够检测到病毒抗原阳性细胞，该毒株（TTSuV1-SY）第2代和第3代细胞培养物仍能检测到病毒抗原阳性细胞，表明病毒拯救获得成功。但自第4代起无阳性细胞出现，表明拯救的毒株无法适应体外培养。为了阐明拯救毒株的Cap蛋白在细胞中抗原定位，用TTSuV1-SY转染细胞培养物，经抗病毒Cap的多抗和荧光标记二抗反应孵育，用共聚焦显微镜观察到该病毒Cap蛋白主要在细胞质内合成，随后转入细胞核内定位。Western blotting分析表明，TTSuV1Cap蛋白分子量37kDa，与预测ORF1编码的蛋白差异较大，推断可能是病毒转录中存在mRNA剪辑。用拯救的TTSuV1-SY株第1代培养物接种30日龄SPF巴马猪3头，病毒接种后试验猪无明显临床症状，体温和体重与对照组无显著差异；病理学观察仅在腹股沟淋巴结有轻微的淋巴滤泡增生，肺脏有轻度间质性肺炎。PCR法检测试验猪小肠和肺脏中病毒核酸呈阳性，表明病毒在猪体内有复制。在TTSuV1ORF1前导序列区设计系列引物，PCR法扩增目的基因片段，借助pGL3-Basic载体和pRL-TK载体，用双荧光素酶报告基因检测系统验证TTSuV1ORF1前导区的启动子活性。结果表明，TTSuV1196nt～525nt序列能够启动萤火虫荧光素酶基因转录，证实这段序列内存在TTSuV1ORF1启动子。对上述序列进行截短，经精细鉴定证实该启动子核心区域为250nt～400nt。在TTSuV1基因组中缺失这段区域后影响蛋白质的表达，反向证实这段区域能够启动ORF1的转录。对TTSuV1ORF1编码区启动子的鉴定，为该病毒分子生物学研究奠定了基础。PCV2Cap蛋白是病毒主要结构蛋白，它能够诱导机体产生中和抗体，具有保护性抗原功能。先前获得的单抗8E4是针对PCV2Cap蛋白的，其具有中和病毒活性，针对的抗原表位为构象表位。Huang等（2011）研究证明，mAb8E4仅与PCV2a基因型的LG株、CL株和JF2株发生特异性反应，而不与PCV2b基因型毒株（YJ和JF）发生反应。本研究将PCV2b/JF株Cap蛋白的第59位精氨酸突变为丙氨酸后，突变毒株能够被mAb8E4识别和中和；同样将PCV2b/YJ株Cap蛋白的第59位精氨酸突变为丙氨酸，以及第60位的丙氨酸突变为苏氨酸后，突变毒株也能够被8E4mAb识别和中和。本研究证实PCV2Cap蛋白中的第59位和第60位氨基酸参与构象表位的形成；并且在PCV2b毒株（JF和YJ）中突变第59位氨基酸或第59/60位氨基酸后能够产生新的中和表位。本研究为进一步确定该中和构象表位和对PCV2不同基因型毒株抗原差异分型提供了科学依据。综上所述，我国猪群中TTSuVs毒株构成复杂，遗传变异率较高；基于TTSuV1Cap蛋白抗原表位序列合成多肽抗原，建立了一种检测该病毒抗体的间接ELISA方法；以感染性克隆技术拯救出TTSuV1-SY毒株，经PK-15和ST细胞体外传代证明该毒株体外培养适应性不强、增殖能力弱，接种试验猪无明显致病性；TTSuV1ORF1启动子的鉴定为该病毒分子生物学研究奠定了基础。此外，本研究阐明了PCV2Cap蛋白中第59位和第60位氨基酸是决定中和构象表位的关键氨基酸。