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不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)原产于中国,在长江流域广泛栽培,是重要的叶菜类蔬菜。随着白菜基因组重测序工作的完成,不结球白菜将是研究芸薹属蔬菜分子育种重要的模式作物。氮素是植物生长发育最重要的营养元素,对农业生产有着深远的影响。硝酸盐是大多数旱地植物利用氮素的主要形态,是植物生长发育重要的营养和信号物质。不结球白菜属于叶菜类蔬菜喜硝态氮,并容易积累硝酸盐,但是关于不结球白菜吸收硝酸盐的分子机制研究鲜有报道。拟南芥负责根部吸收硝酸盐的转运蛋白基因主要有AtNRT1.1、AtNRT1.2、AtNRT2.1和AtNRT2.2.基于拟南芥硝酸盐转运蛋白研究基础和白菜基因组信息,研究不结球白菜的硝酸盐吸收转运机制对于提高氮素利用效率解决硝酸盐积累问题具有重要的意义。本研究以不结球白菜品种‘苏州青’为供试材料,克隆了硝酸盐转运蛋白基因BcNRT1、BcNRT1.1、BcNRT2.1以及BcNRT1、BcNRT1.1的启动子序列,研究了不同浓度硝酸盐处理下各个基因表达模式,利用BcNRT1、BcNRT1.1特异启动子序列研究了基因在植物体内的表达部位,通过蛙卵试验以及转化拟南芥突变体研究了硝酸盐转运蛋白的转运功能和信号功能。主要研究结果如下：1.不结球白菜硝酸盐转运蛋白基因BcNRT1的克隆及其在多形汉逊酵母中的表达从不结球白菜品种‘苏州青’中克隆获得了硝酸盐转运蛋白基因BcNRTl cDNA的全序列2067bp。其氨基酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜和烟草等具有较高序列同源性。BcNRTl蛋白结构域分析结果显示其具有12个跨膜结构域,在第6和第7个跨膜区之间有一个大的亲水环。该基因在GenBank中的登录号为JF439305。通过PCR扩增BcNRTl完整的编码框序列,构建pYNR-EX-BcNRT1重组质粒,并转化酵母菌株NCYC495。转化菌株经过硝酸盐诱导后提取酵母蛋白,经过SDS-PAGE电泳,获得一条约65KDa特异蛋白质条带,与预测蛋白分子量大小一致。2.不结球白菜硝酸盐转运蛋白基因BcNRT1的表达特征和功能研究从不结球白菜基因组序列中克隆获得BcNRTl基因的启动子序列并连接到G3载体。通过花序侵染拟南芥获得转基因植株。对阳性植株进行GUS染色,结果表明BcNRTl基因优先在主根和侧根的根尖和地上部生长点表达。利用GATEWAY技术构建YFP融合表达载体并转化不结球白菜叶片原生质体,通过激光共聚焦显微镜观察发现BcNRT1定位在细胞膜上。体外蛙卵试验结果表明BcNRT1具有低亲和硝酸盐转运活性,但是不能转运氨基酸和寡肽。对转BcNRT1基因的拟南芥突变体chll-5进行氯酸盐处理,发现转基因植株对氯酸盐恢复敏感性,表现出了硝酸盐吸收活性。3.不结球白菜硝酸盐转运蛋白基因BcNRT1.1的克隆和功能研究同源克隆获得了不结球白菜硝酸盐转运蛋白基因的cDNA序列1773bp,命名为BcNRT1.1.该基因在GenBank中的登录号为JQ797419。所推导的氨基酸序列具有12个跨膜结构域和一个大的亲水环。通过BIFC发现BcNRT1.1可以和BcCIPK23相互作用并定位在不结球白菜叶片原生质体细胞膜上。从不结球白菜基因组序列中克隆了BcNRT1.1上游2112bp的启动子区域,构建pBcNRT1.1-GUS载体转化农杆菌GV3101,侵染拟南芥。对阳性植株进行GUS染色,结果表明BcNRT1.1表达部位在植物体内与BcNRT1类似,优先在植物根尖和地上部生长点表达。构建BcNRT1.1过量表达载体转化拟南芥突变体chll-5。转基因植株chll-5在硝酸盐处理0.5h后,NRT2.1基因表达水平比突变体显著提高,表明BcNRT1.1通过调节NRT2.1基因表达参与初期硝酸盐反应。4.不结球白菜硝酸盐转运蛋白基因BcNRT2.1的克隆、表达分析和亚细胞定位同源克隆获得了编码不结球白菜硝酸盐转运蛋白基因BcNRT2.1,包含1593bp的开放阅读框和3’非编码区,编码530个氨基酸。该基因在GenBank中的登录号为JQ797418。其氨基酸序列与拟南芥和甘蓝型油菜具有较高序列同源性。蛋白结构域分析表明,BcNRT2.1具有12个跨膜结构域,在第6和第7个跨膜域之间有1个大的亲水环。实时定量分析表明,BcNRT2.1主要在根部表达,受硝酸盐诱导。高浓度硝酸盐对BcNRT2.1诱导效果比低浓度硝酸盐更为强烈,但是高浓度硝酸盐对于BcNRT11反馈抑制作用也更为明显。亚细胞定位研究表明,BcNRT2.1定位于细胞膜上。5.利用VIGS沉默不结球白菜BcNRTl基因利用芜菁黄化花叶病毒(Turnip yellow mosaic virus, TYMV)载体,成功抑制了不结球白菜八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)基因的表达,验证了病毒载体pTY在不结球白菜上诱导基因沉默的能力,建立了不结球白菜VIGS基因沉默体系。为了进一步研究不结球白菜BcNRTl基因功能,我们将BcNRTl基因的40bp核苷酸序列反向互补克隆到pTY载体,侵染不结球白菜,成功抑制了BcNRTl在转录水平的表达,为其在不结球白菜上深入功能研究奠定了基础。综上所述,通过对克隆得到的3个基因进行表达分析和功能研究,我们发现BcNRT1基因受硝酸盐诱导,优先在生长点和根尖表达,定位于细胞膜上,参与侧根发育,编码1个低亲和硝酸盐转运蛋白。BcNRT1.1基因在地上部生长点和地下根尖表达,参与侧根发育,受磷酸激酶调控并定位于细胞膜上,参与初期硝酸盐反应,可以调控NRT2.1表达。BcNRT2.1基因主要在根部表达,受硝酸盐诱导,其编码蛋白定位于细胞膜上。