论文部分内容阅读
甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）是天然免疫系统中一个关键的可溶性模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR），在天然免疫系统中扮演至关重要的作用。辅助性T细胞17（T help cell17,Th17）是一类分泌IL-17细胞因子（IL-17是Th17细胞特异性的细胞因子）的CD4+T细胞亚群。与MBL同为C型凝集素家族的dectin-1能够促进Th17细胞的分化。那么MBL与Th17细胞之间又有什么关系呢？是否能够调节Th17细胞的分化呢？至今仍然不得而知。因此，深入研究MBL对Th17细胞诱导分化的影响，对阐明MBL在获得性免疫方面的新角色，具有重要意义。 目的： 探讨MBL对Th17细胞诱导分化的影响，为Th17细胞相关的自身免疫性疾病和炎性疾病的治疗提供新思路。 方法： 1.Ficoll密度梯度离心：采用Ficoll密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞（Cord blood mononuclear cells,CBMCs）。 2.免疫磁珠分选：采用免疫磁珠分选法，从上述获得的CBMCs中分选出CD4+T细胞。 3.流式细胞术（FACS）检测：对照组用anti-CD3McAb和anti-CD28McAb活化CD4+T细胞并加入适当浓度的IL-6和TGF-β1作为诱导剂，在对照组的基础上加入不同浓度（1μg/mL、5μg/mL及10μg/mL）的MBL作为实验组。各组细胞培养72h后，利用FACS检测各组中CD4+RORγt+T细胞（即Th17细胞）的比例变化情况。 4.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析：采用qRT-PCR技术分别检测对照组和不同浓度MBL实验组中Th17细胞核转录因子维甲酸孤儿受体-γt（Retinoid-related orphan receptor-γ-t,RORγt）mRNA表达水平。 5.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测：采用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-17A的含量。 6.MBL基因敲除小鼠鉴定：采用基因分型及基因测序等技术分别鉴定小鼠MBL-A基因敲除（MBL-A-/-）、MBL-C基因敲除（MBL-C-/-）、MBL-A基因和MBL-C基因双敲除（即MBL-/-）情况。 7.FACS检测：采用FACS分别检测MBL-/-小鼠和WT小鼠的Th17细胞数量变化。 8.统计学分析：所有数据均运用SPSS22.0软件进行统计学分析，实验数据均以x(-)±s表示，数据采用单因素方差分析法（one-way ANOVA）以及独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01）。 结果： 1.MBL能够显著降低CD4+RORγt+Th17细胞的比例：FACS检测结果显示，与对照组相比，5μg/mL MBL组及10μg/mL MBL组的CD4+RORγt+Th17细胞比例显著降低。 2.MBL能够显著降低RORγt mRNA的表达：qRT-PCR结果显示，与对照组相比，5μg/mL MBL组及10μg/mL MBL组的RORγt mRNA的表达量显著降低。 3.MBL能够显著降低IL-17A的表达水平：ELISA检测结果表明，与对照组相比，5μg/mL MBL组及10μg/mL MBL组的IL-17A分泌水平显著降低。 4.获得MBL基因敲除小鼠：基因分型及基因测序结果显示，成功获得MBL-A基因敲除（MBL-A-/-）、MBL-C基因敲除（MBL-C-/-）、MBL-A基因和MBL-C基因双敲除（MBL-/-）等3个品系的MBL基因敲除小鼠。 5.MBL基因敲除后Th17细胞比例显著上升：FACS检测结果显示，与WT小鼠相比，MBL-/-小鼠CD4+RORγt+Th17细胞比例显著上升。 结论： MBL能够抑制CD4+T细胞向Th17细胞诱导分化。