本课题以乳腺癌c-erbB2癌基因的mRNA作为靶点,以其反义寡脱氧核苷酸(ASODN)为放射性核素的载体,利用99mTc标记的c-erbB2 ASODN与靶基因mRNA的互补结合,再通过纳米技术联合表皮生长因子受体(EGFR)介导增加癌细胞对反义寡脱氧核苷酸的摄取,建立高灵敏度和高靶向性的乳腺癌放射性核素显像新方法,以达到肿瘤早期诊断的目的。表皮生长因子受体(EGFR)与c-erbB2癌基因具有组织分布一致性的特点,在乳腺癌细胞中普遍存在着二者的同时过度表达,而在正常乳腺组织中含量都很低,所以表皮生长因子(EGF)连接白蛋白纳米粒制成靶向纳米粒有以下优势:①通过EGF与其受体EGFR结合,增加了载药纳米粒在乳腺癌细胞膜上的浓聚,加大了细胞内外药物的浓度差,有利于癌细胞摄取反义寡脱氧核苷酸,增加了靶/非靶比值;②通过这种受体与配体的特异性结合促进癌细胞吞噬纳米粒,增加反义寡脱氧核苷酸进入癌细胞的速度和量,从而增加反义寡脱氧核苷酸结合靶基因mRNA的速度和量。白蛋白具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点,其制备的纳米粒具有提高反义寡脱氧核苷酸进入细胞的能力和保护反义寡脱氧核苷酸的作用。本课题采用硫代化学修饰和白蛋白纳米粒增加反义寡脱氧核苷酸的稳定性,避免其在体内被核酸酶降解。方法:第一部分c-erbB2 ASODN的放射性核素标记及鉴定人工合成一段针对c-erbB2 mRNA 5’端转录起始位的反义寡脱氧核苷酸,及相应正义序列、无义序列,采用化学方法连结次乙基双半胱氨酸(EC)与寡脱氧核苷酸(ODN),用Sep-Pak C18反相柱纯化EC-ODN。用SnCl2和酒石酸钠对EC-ODN进行99mTc标记,Sephadex G25柱层析进行纯化,薄层层析测定标记率、比活度、放射化学纯度。分别测定99mTc-EC-ODN在室温和与新鲜人血清37℃孵育后放射化学纯度的变化了解其稳定性。将99mTc-EC-ODN与血浆蛋白37℃孵育测定其血浆蛋白结合率。将-20℃储存的EC-ODN不于同时间取出进行99mTc标记,观察标记率的变化了解其稳定性。以99mTc-EC-ASODN与互补链结合后Sep-Pak C18反相柱洗脱液放射峰的变化和PAGE电泳来观察标记物中ASODN的活性。第二部分靶向纳米粒的制备、鉴定及其对放射性标记寡脱氧核苷酸的包载用二次超声乳化和溶剂挥发技术制备牛血清白蛋白纳米粒(BSANP),采用激光粒径仪测定纳米粒的粒径和分布,透射电镜观察纳米粒形态。用化学方法连接BSANP与EGF,Sephadex G50分离纯化EGF-BSANP,测定粒径和分布。聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定EGF-BSANP的连接情况,用125I标记EGF测定EGF-BSANP上EGF的偶联量,以放射性定量的方法考察EGF-BSANP与BSANP的肿瘤细胞摄取。采用包裹法对放射性标记寡脱氧核苷酸进行靶向纳米粒包载,10%三氯乙酸沉淀后测定包载率和不同时间点的药物释放率,绘制药物释放曲线。纸色谱层析法测定荷99mTc-EC-ODN靶向纳米粒在室温和血清中的放射化学纯度变化来观察99mTc-EC-ODN的稳定性。第三部分荷99mTc-ASODN靶向纳米粒对乳腺癌细胞靶向性的体外研究1.以MDA-MB-231细胞作为细胞对照,观察SK-Br3细胞对荷99mTc-ODN靶向纳米粒和未用靶向纳米粒的99mTc-ODN的摄取,计算各组相应处理因素作用培养不同时间的细胞摄取率。2.计算去各组相应处理因素后不同培养时间的细胞滞留率。3. MTT法测定99mTc-ODN靶向纳米粒对SK-Br3细胞和MDA-MB-231细胞的活力影响。4. RT-PCR半定量分析荷99mTc-ODN靶向纳米粒对SK-Br3细胞c-erbB2 mRNA表达的影响。5. Western blot测定99mTc-ODN靶向纳米粒对SK-Br3细胞c-erbB2蛋白表达的影响。第四部分荷99mTc标记c-erbB2 ASODN靶向纳米粒在小鼠体内的分布及荷瘤裸鼠SPECT显像:荷99mTc-ASODN靶向纳米粒在正常小白鼠及荷人乳腺癌裸鼠的体内分布,荷99mTc-ASODN靶向纳米粒在荷人乳腺癌裸鼠的SPECT显像研究。结果:第一部分c-erbB2 ASODN的放射性核素标记及鉴定EC-ASODN的99mTc标记率为81.2%±7.9% ,比活度为(3.1±0.7)MBq/μg。Sephadex G25分离纯化得到的第1放射峰即为99mTc-EC-ASODN,经24h稳定性分析,其放射化学纯度略有降低,但24h均值大于80%。与新鲜人血清37℃孵育分析其稳定性,经纸层析分析测得放射化学纯度4h比1h略有降低,但4h均值大于85%。99mTc-EC-ASODN在新鲜人血浆蛋白中1h的结合率为(8.2±2.1)%,6h为(11.7±2.5)%;99mTc-EC-SODN 1h为(8.6±2.4)%,6h为(12.8±3.1)%;99mTc-EC-NSODN 1h为(8.3±1.7)%,6h为(10.2±3.6)%。-20℃保存EC-ODN 1d后的99mTc标记率为(81.0±6.4)%,15d为(80.2±5.7)%,30d为(78.0±5.2)%,90d后为(75.2±5.5)%。标记物与互补链在37℃条件下与人血清孵育60min后极性下降,反义寡脱氧核苷酸与互补链杂交后经含7mol/l尿素16% PAGE胶电泳形成清晰的两条带。第二部分靶向纳米粒的制备、鉴定及其对放射性标记寡脱氧核苷酸的包载透射电镜观察,纳米粒形态圆整,大小较均匀。激光散射法测定的BSANP平均粒径为34nm,90%的粒径小于38nm。EGF-BSANP平均粒径为36nm,90%的粒径小于39nm,粒径比BSANP略为增大。SDS-PAGE电泳示,BSANP样品电泳条带与Marker 68kDa接近,而EGF-BSANP样品电泳条带与Marker 75kDa接近。加入5组不同量的EGF与BSANP的偶联率为92.3%～98.9%。SK-Br3细胞对EGF-BSANP浓度为0.1mg/ml～2.0mg/ml的4h摄取率为83.7%～99.2%,对BSANP在相同条件下的4h摄取率为25%～30%。随着培养时间的延长,SK-Br3细胞摄取EGF-BSANP的量逐渐增加,0.5h为(50.3±3.7)%,4h为(97.2±5.5)%;而对BSANP的摄取率则维持在25%～35%。靶向纳米粒对3种99mTc标记c-erbB2寡脱氧核苷酸的包封率和载药量在加入相同浓度标记物的情况下无显著性差异,但随着加入标记物浓度的增加,包封率逐渐下降而载药量逐渐上升。3种标记寡脱氧核苷酸纳米粒的释药趋势基本相同,均表现为对包载药物的缓慢释放。99mTc-EC-ASODN被靶向纳米粒包载后在中性pH溶液中,室温放置24h后的放化纯度为(88.6±6.3)%,99mTc不易脱落,较未用靶向纳米粒包载的室温稳定性好。血清中4h放射化学纯度为(92.7±6.1)%,与0.5h的放射化学纯度(95.5±8.1)%差异无显著意义(P>0.05),较未用靶向纳米粒包载的血清稳定性更好。第三部分荷99mTc-ASODN靶向纳米粒对乳腺癌细胞靶向性的体外研究1. SK-Br3细胞对荷99mTc-ASODN靶向纳米粒的摄取率,30min为(16.92±1.91)%,60min达峰值(21.70±2.10)%,然后逐渐下降,在240min为(7.11±2.76)%。MDA-MB-231细胞对非靶向纳米组99mTc-ASODN的摄取率30min为(12.27±2.76)%,60min达峰值(13.19±2.34)%,在240min为(3.70±1.91)%。SK-Br3细胞和MDA-MB-231细胞的累积摄取率都随时间而逐渐增加,但二者对99mTc-ASODN的累积摄取率有较明显的差异。2. SK-Br3细胞对荷99mTc-ASODN靶向纳米滞留率呈缓慢下降的趋势,15min滞留率为(92.26±9.19)%,60min为(73.70±6.10)%,360min为(43.70±3.10)%;对荷99mTc-SODN靶向纳米组15min滞留率为(93.18±8.02)%,60min为(54.91±5.96)%,360min为(5.24±1.27)%;对荷99mTc-NSODN靶向纳米组15min滞留率为(92.62±9.50)%,60min为(54.91±5.96)%,360min为(4.91±1.88)%。99mTc-SODN和99mTc-NSODN靶向纳米组呈快速下降趋势,与99mTc- ASODN靶向纳米组有明显差异。3. MTT法检测荷99mTc-ASODN靶向纳米粒对SK-Br3细胞和MDA-MB-231细胞的抑制率分别为(26.5±6.4)%和(6.5±3.1)%,差异具有显著性(P<0.01);99mTc-ASODN对SK-Br3细胞和MDA-MB-231细胞的抑制率分别为(14.8±3.4)%和(5.1±3.6)%,差异具有显著性(P<0.01)。99mTc-ASODN靶向纳米粒和99mTc-ASODN对SK-Br3细胞的抑制率差异具有显著性(P<0.01)。4. RT-PCR检测c-erbB2基因mRNA水平结果显示:荷99mTc-ASODN靶向纳米组中c-erbB2 mRNA的表达(灰度值为60.63±3.3),较未用靶向纳米粒99mTc-ASODN组(灰度值为96.82±5.1)mRNA表达较弱,差异有显著性(P<0.01)。5. Western blot检测SK-Br3细胞c-erbB2蛋白表达结果示:采用靶向纳米介导99mTc-ASODN组对SK-Br3细胞c-erbB2蛋白的表达抑制率明显高于未用靶向纳米介导99mTc-ASODN组,差异有显著性(P<0.01)。第四部分荷99mTc标记c-erbB2 ASODN靶向纳米粒在小鼠体内的分布及荷瘤裸鼠SPECT显像:1. 99mTc-ASODN与荷99mTc-ASODN靶向纳米粒在正常小鼠体内分布:99mTc-ASODN注射后血清除迅速,荷99mTc-ASODN靶向纳米粒在血中清除较缓慢,2种标记物在不同时间血中滞留量有明显区别。2.荷人乳腺癌裸鼠模型的体内分布:荷99mTc-ASODN靶向纳米粒的放射性瘤/血、瘤/肌肉比值逐渐升高,在2h达峰值(瘤/血、瘤/肌肉比值分别为3.31±0.61、14.87±6.06),后略有下降。99mTc-ASODN放射性瘤/血、瘤/肌肉比值升降趋势与荷99mTc-ASODN靶向纳米粒相似,但同一时间点的放射性瘤/血比值相对较低。3. 2h进行荷人乳腺癌裸鼠SPECT静态显像,肿瘤部位放射性浓聚,可见到较清晰的肿瘤显像。结论:本研究中ASODN以螯合剂EC与99mTc连接,形成的EC-ASODN其标记率高,放化纯高,比活度符合要求,与血浆蛋白结合率低,复合物稳定。99mTc-EC-ASODN中的ASODN具较高的杂交活性。采用化学合成法连接EGF与牛血清白蛋白纳米粒制成靶向纳米粒,具有较强的靶向性和较好的ASODN包载效果,靶向纳米粒对ASODN的包载提高了ASODN在血清中的稳定性,为在体内将ASODN高比例的导入肿瘤细胞内提供了较好的载体。反义显像无疑是一种很有前途的早期诊断肿瘤的方法,白蛋白靶向纳米粒载体又为其进一步应用展示了广阔的前景,为乳腺癌的的早期诊断、个体化治疗和预后判断提供新的手段。