肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一,每年将影响世界上的百万人口。在中国,肝癌的发病率位于肿瘤发病率的第三位,而死亡率排在第二位。目前,外科手术仍是肝癌根治的主要手段,但即使进行了肝癌根治性切除术,其临床效果也是不确定的,长期预后效应不佳,术后5年内的生存率为17%-53%。因此,探讨相关病因及病理机理,寻找临床诊断标记物和治疗靶分子,对肝癌诊疗的理论指导和临床应用具有重要意义。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是细胞内一种非组蛋白DNA结合蛋白,参与多种生物学过程包括基因转录、DNA修复、重组、复制以及细胞运动等。HMGB1可释放到微环境中参与细胞外信号转导,并调节细胞生长和分化。研究发现HMGB1在多种肿瘤细胞中高表达,包括胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌等,并促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,提示其可能成为癌症治疗的潜在靶标。有研究报道,HMGB1在肝细胞癌患者血样中的含量高于慢性肝炎和肝硬化患者以及正常人。然而其在肝癌中的具体功能和作用机制仍不明确,有待于深入研究。为深入探讨HMGB1在肝癌细胞增殖和侵袭中的作用及其调控机制,本课题以肝癌细胞株HCCLM3为研究对象,开展了如下主要研究。1)分析HMGB1对肝癌细胞体外生物学性状的影响。设计特异性siRNA干扰HCCLM3细胞中HMGB1的表达,应用CCK8试剂检测细胞增殖、流式细胞仪分析细胞周期和凋亡、Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。2)裸鼠皮下成瘤实验。构建稳定干扰HMGB1的HCCLM3细胞株,通过裸鼠皮下接种成瘤模型,检测HMGB1对肝癌细胞在裸鼠体内成瘤生长的影响。3)探讨HMGB1在肝癌细胞中的作用机制。应用Western Blot分析HMGB1对HCCLM3细胞内MAPKs, AKT和NF-κB等信号通路的调节,以及对CDK抑制因子p21waf/cip1表达的影响及其调控机制；通过明胶酶谱方法分析HMGB1对HCCLM3细胞分泌基质金属蛋白酶的影响。经过上述研究,本课题获得以下主要结果：1)利用siRNA能够有效干扰HMGB1在HCCLM3细胞中的表达。干扰HMGB1可以抑制HCCLM3细胞增殖、促进凋亡、引起细胞周期阻滞,同时降低其体外迁移和侵袭能力。这些结果提示HMGB1在肝癌细胞中具有抗凋亡、促增殖、促迁移和侵袭的作用。2)裸鼠皮下成瘤实验表明,稳定干扰HMGB1能够抑制HCCLM3细胞在裸鼠体内的肿瘤生长。与对照组相比,HMGB1稳定干扰株的成瘤生长速度及最终的瘤块体积和重量均显著下降。3) HMGB1可以增强MAPKs和NF-κB信号通路活性。稳定干扰HMGB1的HCCLM3细胞内MAPKs的磷酸化水平降低,包括ERK1/2(p44/p42). p38和SAPK/JNK (p54/p46),同时它们的上游激酶(MEK1/2>SEK1)和下游底物(c-Jun-. c-Myc)的磷酸化也被抑制；NF-KB/p65的表达量及Ser536位点的磷酸化水平也下调；但AKT的表达量和活性基本不变。在该细胞内重新提高HMGB1的表达后,MEK1/2, ERK1/2, p38和c-Myc的磷酸化水平以及NF-KB/p65的表达量和Ser536位点的磷酸化水平均有所回升,但SEK1、SAPK/JNK和c-Jun的磷酸化水平未见回升。4) HMGB1抑制p21的表达。干扰HMGB1, HCCLM3细胞内p21蛋白的表达量上调；而提高HMGB1的蛋白水平后,p21的表达则下调。干扰HMGB1可能通过此机理引起细胞周期阻滞并抑制增殖。在此过程中,p53的表达及磷酸化均未发生变化,提示HMGB1对p21表达的调控可能为p53非依赖途径。5)HMGB1促进基质金属蛋白酶MMP2的表达。稳定干扰HMGB1,HCCLM3细胞培养液中MMP2的活性成分减少；在提高HMGB1的蛋白水平后,其活性回升。这可能是HMGB1促进HCCLM3细胞体外侵袭的原因之一。以上结果提示,HMGB1可以促进肝癌细胞的增殖和体外侵袭,其部分机制为增强MAPKs和NF-κB信号通路的活性,并抑制p21的表达,促进MMP2的表达。HMGB1对p21表达的调控为p53非依赖性,而MAPKs/c-Myc途径可能是其作用机制之一。c-Myc为MAPKs通路下游的关键转录因子,是p2l表达的重要负调控分子,HMGB1可以提高MAPKs/c-Myc的活性,可能由此抑制p21的表达。除此之外,HMGB1在肝癌中的更多作用及其机制仍有待于深入探讨。