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背景:动脉新生内膜形成引起动脉狭窄,最终导致组织缺血缺氧,是引起心力衰竭或移植物衰败的主要原因,其分子机制目前尚不明确。Toll样受体4(TLR4)作为固有免疫的重要组成部分,其在感染性疾病中的作用已得到较为详尽的阐述,但在动脉新生内膜形成中的作用及其可能的潜在机制,尚未得到阐明。目的:探讨TLR4信号通路在小鼠大动脉新生内膜形成中的作用及其分子机制,寻找可能可行的治疗药物。方法:第一部分1.建立小鼠同种主动脉移植模型,将BALB/c(H-2d)供体主动脉移植到C57BL/6(H-2b)受体中,检测移植物血管相关的病理变化,TLR4的表达及定位。2.TLR4抑制剂干预:对小鼠血管移植模型给予TLR4特异性抑制剂TAK-242处理,手术前1天、手术当天以及随后每隔一天,持续8-12周。3.检测手段和指标:(1)免疫组化及免疫荧光染色检测损伤血管浸润的炎症细胞及TLR4表达情况;(2)RT-q PCR、蛋白印迹检测TLR4信号通路的表达;(3)FACS检测巨噬细胞的比例;(4)ELISA检测共培养体系中炎症因子和趋化因子的表达;(5)建立共培养体系及细胞趋化试验确认作用靶点。第二部分1.建立小鼠内膜增生/动脉重构模型,将右颈总动脉与颈动脉分叉处附近用丝线缝合结扎,检测病变血管相关的病理变化。2.CD40抗体及CD40/TRAF抑制剂干预:对小鼠内膜增生/动脉重构模型给予CD40抗体或者CD40/TRAF抑制剂6877002,持续4周。3.检测方法和指标:(1)免疫荧光、免疫组织化学染色测病变血管浸润的炎症细胞;(2)RT-q PCR、胶原酶活性检测测定MMPs的表达;(4)流式细胞术检测T细胞,B细胞和巨噬细胞的比例;(5)培养骨髓巨噬细胞检测药物作用。结果:第一部分1.本研究成功建立小鼠主动脉移植模型,同种移植移植物血管内膜增生明显多于同系移植物,炎性细胞浸润程度也明显较同系移植物重。TLR4参与小鼠主动脉移植模型的血管内膜增生,其主要定位在巨噬细胞。2.TLR4抑制剂TAK-242阻断TLR4减轻同种异体主动脉移植中的内膜增生,推迟新生内膜的形成;TAK-242通过降低移植后外周血,骨髓和脾脏中Ly6Chi巨噬细胞的生成,减少移植物局部CD68+巨噬细胞的浸润。3.TLR4抑制剂TAK-242通过抑制NF-κB信号通路削弱小鼠血管移植模型中IL12p70/IFNγ轴的影响,从而减少移植物新生内膜中促炎细胞因子和趋化因子表达,减少了CCL2介导的血管平滑肌迁移。第二部分1.本研究成功建立小鼠血管内膜增生/动脉重构模型,TLR4下游CD40阻断后减轻新生内膜形成和动脉重塑,降低新生内膜形成和动脉重塑中明胶酶和胶原酶的活性。2.TLR4下游CD40/TRAF6抑制剂6877002的使用能明显减轻新生内膜形成和动脉重塑,减少炎症浸润和胶原转换,明显抑制了M1极化反应,诱导调节性巨噬细胞亚型的生成。结论:1.TLR4参与了小鼠主动脉移植模型和小鼠血管内膜增生/动脉重构模型的新生内膜形成。其主要机制可能为:(1)参与巨噬细胞极化,促进炎症因子的分泌;(2)促进IL12p70/IFNγ轴自循环,进一步增强炎症反应及组织修复。2.TLR4的抑制剂以及CD40/TRAF6抑制剂分别可明显减两种新生内膜形成模型的血管病变。