研究背景:支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)是由嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞参与的气道慢性炎症,这种炎症使易感者对各种激发因子具有气道高反应性,引起气道痉挛、缩窄等,表现为反复发作性喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状,常在夜间和(或)清晨发作、加剧。支气管哮喘是当今世界上最常见的慢性气道炎症性疾病,据不完全统计,全世界约有1亿以上的哮喘患者,我国至少也有1-2千万。近年来有资料显示其发病率逐年上升。由此可见,哮喘严重危害着人们的健康,因此,把哮喘作为一个重点、难点的课题来研究是及其重要的。近年研究发现,哮喘的发生不仅存在着气道炎症,还存在着不同程度的气道壁结构改变,即气道重构,气道炎症与气道重构是哮喘的两个主要病理学特征。气道重构是指广泛的气道结构改变,如气道壁的增厚,基底膜变性和增厚,平滑肌的增生、肥厚,上皮下的纤维化等,气道上皮下纤维化主要表现为网状层密度和厚度的增加,与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原,纤维结合蛋白以及胞外介质的沉积有关。气道壁的增厚以及气道平滑肌的增生、肥厚等,导致了气道的狭窄,气流阻力的增加和气道高反应性。如今认为哮喘是一种Ⅰ型变态反应已取得了普遍的共识,IgE依赖的T细胞调控机制是哮喘的主要免疫学机制,认为哮喘病的发生与Th1/Th2的比例失调有关,而INF-r是一种Th1细胞因子,IL-4是一种Th2细胞因子,且IFN-γ及IL-4分别为Th1和Th2的特征性细胞因子。近几年,通过调整Th1/Th2细胞亚群失衡来治疗哮喘已成为研究的热点,而调节IL-4的水平是调整Th1/Th2失衡的重要靶点。糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、调节机体免疫功能的作用,是目前治疗哮喘的第一线药物,但长期应用其副作用明显。中医认为本病属于“哮证”范畴,总属本虚标实,本虚主要指肾虚,标实重点指肺实,故其病变之脏当以肺肾为要,传统中医针灸理论形成的天灸疗法在治疗哮喘方面有独特的疗效,现被广泛应用于临床,但所使用的多仍为中药膏剂或即时手工制作的膏饼,剂型相对落后。基于此,本课题研发TDD药贴,并对其进行临床前研究,TDD药贴已由南方医科大学中医药学院制剂教研室研发成功,它是根据《张氏医通·喘门》“冷哮方”的药物加麻黄组成,利用现代药物提纯技术和药物经皮吸收技术制作而成的一种天灸新剂型,是中国古代天灸疗法的发展,具有药物吸收快、生物利用度高、给药持久、副作用少的特点。用此药贴敷贴于大椎、双肺俞、双肾俞,一方面这些穴位发挥宣肺平喘、化痰止咳,补肾纳气及疏通经络等作用,另一方面这些具有温肺散寒、化痰止咳、宣肺平喘,辛温走窜药物被吸收后发挥其特殊的药理作用,从而共同达到止咳平喘化痰的作用。目的:通过鸡卵清蛋白(OVA)生理盐水腹腔注射致敏并雾化吸入诱喘来制作实验性哮喘豚鼠,观察穴位贴敷TDD药贴对实验性哮喘豚鼠血清IL-4、IFN-γ水平的影响以及支气管肺组织的病理形态学改变情况,以探讨穴位贴敷TDD药贴对哮喘治疗的可能疗效机制,为TDD药贴的开发和应用提供理论基础。方法:(1)造模:将豚鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、地塞米松组及TDD药贴组,每组12只,共48只。除空白对照组外其余3组均用鸡卵清蛋白(OVA)生理盐水造模,其步骤如下:①致敏:第4d,用由OVA和生理盐水配制成10%的混悬液1mL给豚鼠腹腔皮下注射,使其处于致敏状态;②诱喘:第18d开始,将致敏的豚鼠置于密闭透明的塑料盒内,给予1%OVA生理盐水浑悬液雾化吸入加以激发,每次20-30 sec,隔天一次,共7次,以腹式呼吸明显,呼吸频率加快且节律不整,活动减少等症状为诱喘成功;③正常对照组以生理盐水代替OVA生理盐水混悬液,其致敏及诱喘方法同上。(2)治疗:TDD药贴组于第18d激发哮喘后开始给药,每次敷药6h,隔日1次,共给药7次。选穴如下:大椎、双肺俞、双肾俞,方法如下:将豚鼠颈背部相应穴位处用宠物电剪刀剪毛,剪毛范围:纵向大椎至肾俞,横向脊柱两侧各旁开1.5cm,后将TDD药贴贴敷于穴位处。地塞米松组采用腹腔注射地塞米松注射液0.5mg/kg,治疗时间与次数同TDD药贴组。模型组造模后,与TDD药贴组和地塞米松组一样诱喘但不予其他干预措施。正常对照组除用生理盐水模仿其他组致敏及诱喘外,不给予任何干预措施。(3)取材:第31d,在末次致喘后2～4h内,用3%戊巴比妥钠,50mg/kg腹腔注射麻醉所有豚鼠,迅速断头取血,每只取5ml,然后室温放置2h后,3000转/min离心15min,取上清液,放冰箱-20℃保存待测,后严格按照试剂盒说明采用免疫组织化学法(ELISA)测定每组每只豚鼠血清中IL-4、IFN-γ的含量。采血完毕后,取右侧支气管组织1mm×1mm大小4块,用10%的甲醛溶液固定,12h内石蜡包埋,冠状切片,并行HE染色,最后由病理专科医生在未知实验分组情况下,用10×40高倍视野对所有标本进行分析,观察支气管肺组织的病理形态学改变。结果:在造模及治疗阶段:正常对照组死亡豚鼠2只,模型组死亡6只,地塞米松组死亡4只,TDD药贴组死亡6只。(1)采用ELISA法检测IL-4的结果示:模型组豚鼠血清IL-4水平明显高于正常对照组、TDD药贴组、地塞米松组(P＜0.01);TDD药贴组、地塞米松组豚鼠血清IL-4水平高于正常对照组(P＜0.05);TDD药贴组与地塞米松组豚鼠血清IL-4差异无显著性意义(P＞0.05)。(2)采用免疫组织化学法检测IFN-γ的结果示:正常对照组IFN-γ水平明显高于其他3组(P＜0.01);地塞米松组IFN-γ水平明显高于TDD组与模型组(P＜0.01);TDD组IFN-γ水平明显高于模型组(P＜0.01)。(3)光镜下观察各组哮喘豚鼠支气管肺组织的病理形态学改变:①正常对照组:支气管粘膜上皮完整,平滑肌无明显的增厚,肺泡壁清晰完整,间隔形态正常,无明显的炎症细胞浸润;(附图1)②模型组:支气管管壁粘膜上皮细胞受损和脱落明显,气道壁不完整,粘膜下层炎症明显,气道平滑肌增厚,胶原纤维增加,管腔狭窄,气道腔内粘液分泌增多,粘液栓堵塞,气道周围嗜酸性粒细胞明显增加,肺泡内可见弥漫性慢性炎细胞浸润、管腔变窄,肺泡基本上实变,充满了炎症细胞,有肺大泡形成,肺泡间隔有明显充血;(附图2)③地塞米松组:支气管粘膜上皮基本完整,管壁平滑肌层有轻度的增厚,间质炎症细胞较少,肺泡间隔基本完整,腔内有少量的炎症细胞,肺泡间隙轻度充血以及有少数的炎症细胞浸润;(附图3)④TDD药贴组:支气管的粘膜上皮基本完整,平滑肌层有轻度的增厚,管周有少量的炎症细胞,肺泡完整,间质轻度充血。(附图4)结论:支气管哮喘是多种炎症细胞和细胞因子参与的慢性气道炎性疾病,目前Th1和Th2类细胞因子失衡在支气管哮喘发病中的作用已引起了人们的关注,IFN-γ及IL-4分别为Th1和Th2的特征性细胞因子。从实验的结果来看,TDD药贴可降低实验性哮喘豚鼠血清中IL-4的水平而升高IFN-γ的水平,提示TDD药贴对哮喘豚鼠的治疗机制主要是通过阻断或抑制Th2细胞的活化而减少IL-4的分泌,刺激Th1细胞IFN-γ的分泌,从而调整Th1/Th2的失衡状态,来抑制气道的炎症反应,降低豚鼠模型气道内膜的厚度、纤维组织厚度及小气道的平滑肌厚度,改善哮喘豚鼠气道重构的改变,达到治疗哮喘的作用;而TDD药贴刺激Th1细胞分泌IFN-γ的作用不如地塞米松强。这可能是TDD药贴对哮喘的治疗作用机制之一。