背景：
　　尘螨是引起吸入性过敏疾病常见的过敏原，在发展中国家约15%-20%的人对尘螨过敏[1]。随着过敏性疾病发病率增长，世界各国变态反应学者对尘螨过敏机制及特异性免疫治疗的研究也越来越重视[2]。尘螨主要包括屋尘螨(Der p)和粉尘螨(Der f)两大类，能够引起过敏性皮炎、过敏性鼻炎及过敏性哮喘等疾病。粉尘螨Derf2广泛存在于人类生存环境中，是一种主要过敏原，该蛋白相对分子量为17kD，大约90%尘螨过敏患者对Derf2过敏，患者血清能检测出Derf2特异的IgE。果蝇S2细胞表达系统结合了昆虫高水平表达和哺乳动物稳定表达的优点，以金属硫蛋白为启动子，能够使重组蛋白稳定表达，而且具有翻译后修饰的功能。为得到与天然Derf2蛋白生物活性、结构更贴近且无内毒素的Derf2重组蛋白，本研究选择昆虫表达系统S2细胞表达Derf2重组蛋白。
　　目的：
　　将Derf2基因分别克隆至果蝇表达载体pMT-Bip/V5-HisA和pAc5.1-HisB中，构建pMT-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-eGFP、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-His重组质粒。将上述重组质粒分别采用瞬时转染和稳定转染的方法转入果蝇S2细胞，从而构建Derf2蛋白的果蝇细胞表达体系。表达的Derf2蛋白可作为评价Derf2蛋白过敏原性的实验材料。
　　方法：
　　1、根据Derf2基因序列和实验要求设计PCR引物，添加适合的酶切位点及标签；
　　2、PCR扩增获得Derf2目的片段，将其克隆至T克隆载体(pEASY –Blunt Simple Cloning Vector)并进行菌落PCR和双酶切鉴定；将鉴定正确的目的基因克隆至果蝇表达载体pMT-Bip/V5-HisA和pAc5.1-HisB中，构建pMT-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-eGFP、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-His重组质粒，进行菌落PCR、双酶切和测序鉴定；
　　3、瞬时转染S2细胞：用磷酸钙化学转染方法及试剂盒非脂质体转染方法瞬时转染上述重组质粒至S2细胞中。RT-PCR检测S2细胞中Derf2基因表达及WesternBlot检测Derf2蛋白表达；
　　4、稳定转染S2细胞及稳定表达细胞系筛选：利用重组质粒pAc5.1-Derf2-StrepⅡ与抗性质粒pCoHygro共同转染果蝇S2细胞，筛选稳定表达重组蛋白Derf2的果蝇S2细胞系。
　　结果：
　　1、成功构建pMT-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-eGFP、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-His重组质粒；
　　2、利用试剂盒非脂质体转染方法瞬时转染S2细胞后，pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-eGFP、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-His质粒均能成功表达Derf2基因及Derf2蛋白；
　　3、重组质粒pAc5.1-Derf2-StrepⅡ与抗性质粒pCoHygro共同转染至S2细胞(非脂质体转染试剂盒)，抗生素潮霉素B筛选4周后，获得稳定表达Derf2蛋白的S2多克隆细胞株。
　　结论：
　　本研究构建了含Derf2基因的重组质粒pMT-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-eGFP、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ、pAc5.1-Derf2-StrepⅡ-His，可用于S2细胞的瞬时转染及稳定转染，成功使尘螨Derf2蛋白在果蝇S2细胞中表达，并获得稳定表达Derf2蛋白的S2细胞系。