猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻和死亡的重要病原之一。目前，虽然商品化PEDV疫苗已普遍使用，但该病在我国仍广泛流行，并引起严重的经济损失。因此，一种安全、有效新型疫苗的研制已成为必然趋势。　　 sM、M、S蛋白是在PEDV的重要结构蛋白，可自行组装成病毒样颗粒，诱导机体产生类似于全病毒的抗病毒免疫反应。本研究首先利用RT-PCR技术把sM、M、S基因分别克隆入腺病毒表达载体系统中，成功构建了三个重组腺病毒rAd-sM、rAd-M、rAd-S，然后将这三个具有感染能力的复制缺陷性重组腺病毒共同感染Vero细胞，以期得到病毒样颗粒，并在小白鼠体内进行免疫特性研究，为研究PEDV新型疫苗奠定基础。　　 本研究根据GenBank数据库中PEDV基因序列设计了五对引物sM-P1/sM-P2、M-P1/M-P2、S1-P1/S1-P2、S2-P1/S2-P2、S3-P1/S3-P2，其中sM-P1、M-P1分别含有Bg/II酶切位点和起始密码子ATG，S1-P1含有Xho I酶切位点和起始密码子ATG，sM-P2、M-P2、S3-P2分别含有EcoRV酶切位点和终止密码子TAA、TAA、TGA。通过RT-PCR技术、重组PCR技术从PEDV疫苗株中分别扩增获得大小为231bp、681bp、4152bp的PCR产物，经纯化后与克隆载体pMD18-T连接，连接产物转化DH5a，然后在氨苄抗性(Amp+)平板上挑取阳性菌落，37℃过夜培养。提取质粒经双酶切鉴定，结果扩增片段与预期片段大小相符，DNA测序分析结果表明，扩增片段完全正确。将鉴定正确的重组质粒pMD18-T-sM、pMD18-T-M、pMD18-T-S与穿梭载体pShuttle-CMV同时进行双酶切，分别经回收后连接。连接产物转化DH5a，然后在卡那霉素抗性（Kan+）平板上挑取阳性菌落，37℃过夜培养。经菌液PCR鉴定，结果所扩增的片段与预期片段大小相符；DNA序列分析结果表明，所插入的基因片段阅读框完全正确。将鉴定的重组质粒pShuttle-sM、pShuttle-M、pShuttle-S分别用Pme I进行线性化，然后转化到含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中，经过同源重组，在具有卡那霉素的LB平板上筛选阳性菌落，然后利用Pac I对重组质粒进行酶切鉴定，结果与预计的相符，阳性重组质粒分别命名为pAd-sM、pAd-M、pAd-S。经鉴定后，大量提取重组质粒，PacI酶切线性化，阳离子脂质体法转染到AD-293细胞中，于37℃培养8天后出现细胞病变，收获病毒。经RT-PCR检测，目的基因存在于重组腺病毒中且都在转录水平得到表达，测得重组腺病毒rAd-sM、rAd-M、rAd-S的TCID50分别为10-8.19、10-8.41、10-7.29/0.1 mL。将获得的重组腺病毒rAd-sM、rAd-M、rAd-S共感染Vero细胞，经RT-PCR、Western-Blot鉴定，重组腺病毒中的三个蛋白基因均在Vero细胞中得到了转录和表达。　　 将16只18-20g的雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组4只。第1，2组分别肌注和口服免疫PEDV rAd-sM、rAd-M、rAd-S共感染Vero细胞所得表达上清，第3、4组分别免疫腺病毒和PBS以作为阴性对照和空白对照。首免后间隔14d加强免疫一次，共免疫两次。于5周龄尾静脉取血，通过Western-Blot进行中和抗体的检测，结果表明BALB/c小鼠体内有抗体产生。　　 综上所述，本研究成功构建了3株重组腺病毒，且共同感染Vero细胞能够表达PEDV的sM、M、S蛋白。小鼠免疫试验证实，共感染Vero细胞所得蛋白具有一定的免疫原性，这为PEDV新型疫苗的研究奠定了重要基础。