研究背景致死性室性心律失常包含室性心动过速(VT)、室性颤动(VF)是急性心肌梗死(AMI)后高发生率的并发症,超过90%的心源性猝死(SCD)由此引发。虽然口服或静脉抗心律失常药品、射频消融术或置入埋藏式心律转复除颤器(ICD)已在AMI病人预防SCD中被积极应用,但仍有很多患者反复发作快速性为主的心律失常。既往报道指出AMI后早期心律失常频发与心脏自主神经状态失衡即交感神经激活关系密切,因此对交感神经激活机制进行深入探索以减少AMI初期致命性心律失常频发成为心血管领域研究的重点之一。下丘脑室旁核(PVN)是重要的调节心血管活动的中枢核团,电生理实验证明PVN中神经元受到刺激后将影响外周交感神经的活性。已有研究表明PVN中炎性反应参与AMI后交感神经兴奋,然而深层次机制不甚明朗。AMI后早期PVN中小胶质细胞被激活并引起局部固有免疫应答,Toll样受体4(TLR4)作为一种模式识别受体(PRR)发挥固有免疫功能,小胶质细胞是其位于中枢神经系统(CNS)的主要表达细胞。当其被特定配体如微生物或组织损伤产生的内源性物质刺激后,进一步激活小胶质细胞,触发NF-κ B激活及促炎性因子TNF-α、IL-1 β等分泌。TLR4作为一种炎症受体在多种疾病中发挥作用,但PVN中TLR4是否参与急性心梗早期交感神经激活尚无报道。有报道指出,在心衰及高血压大鼠模型中,PVN内活性氧(ROS)表达增多,侧脑室(ICV)给予ROS清除剂可降低心力衰竭及高血压导致的交感神经激活,是否于AMI早期也有此现象尚未可知。多项研究结果显示TLR4可引起免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞产生ROS,进一步,心力衰竭动物被发现PVN高表达的NF-κ B能够引发氧化应激及交感激活。由此我们提出假说,PVN小胶质细胞的TLR4通过介导NF-κ B信号通路及ROS产生参与心梗后交感神经的激活。研究目的我们旨在探讨心梗早期PVN中TLR4的活性状态及细胞定位,其在心梗后是否参与交感神经活性调节及可能的下游机制。研究方法实验一43只健康SD大鼠(50-60天龄,约260g)被随机分成5组,分别为空白组及心梗后1、3、5、7天组。心梗模型结扎其左冠状动脉,对照模型只穿线相应部位冠脉但不打结。于各组规定心梗手术天数时处死模型,取材PVN组织。Western blot 实验检测各组 PVN 组织内 TLR4、NF-κB、NF-κB inhibitor-α(1κB-α)及 NADPH oxidase 2(NOX2)蛋白表达量。实验二181只大鼠(品质同上)随机分至以下几组:(1)假手术+携带对照shRNA的腺病毒相关病毒2(AAV2,含绿色荧光蛋白);(2)假手术+携带TLR4 shRNA的AAV2;(3)心梗模型+携带对照shRNA的AAV2;(4)心梗模型+携带TLR4shRNA的AAV2。应用大鼠立体定位仪定位PVN区域,微量泵放置含量为50nl的注射器用0.1 μ 1/min的快慢注射对照shRNA或者TLR4 shRNA至PVN组织。为保证目的蛋白干扰水平,于同一干扰试剂中我们制备了三条干扰序列:GCATAGAGGTACTTCCTAATATTCAAGAGATATTAGGAAGTACCTCTATGCTTTTTT;GAATGCCAGG ATGATGCCTCTTCAAGAGAGAGGCATCATCCTGGCATTTTTTT;GCGAGCTGGTAAAGAATTTATTCA AGAGATAAATTCTTTACCAGCTCGTTTTTT。病毒滴度为 1.0x1013 颗粒/ml。注射病毒四周后,各组大鼠开胸行心梗手术或假手术,造模方法同实验一。术后当日给予小动物遥测技术装置,直至取材前拆除,用于行心率变异性分析。术后三天(取材前),行肾交感神经活性(RSNA)测定及电生理检查。取材循环血液及梗死灶周心肌组织,ELISA检测去甲肾上腺素(NE)浓度。取材PVN,Westernblot 测定 TLR4、NF-κ B、NOX2 等含量,ELISA 检验 PVN 内 IL-1 β、TNF-α 的分泌水平,免疫荧光定位TLR4表达,免疫组化检测神经元激活情况及定位,光泽精化学发光技术测定PVN组织活性氧水平,超氧化物阴离子荧光探针技术(DHE)检测脑内ROS水平及定位。实验三62只大鼠随机分至4组:(1)空白组;(2)生理盐水组;(3)脂多糖组(LPS,每0.5μg粉末配制于50nl蒸馏水);(4)LPS+吡咯烷二硫氨基甲酸盐(PDTC,注射速度为5 μg/h)。第(4)组使用微量泵注射PDTC试剂时,其余各组相同剂量及速度注射人工脑脊液(aCSF)作为对照至PVN内,持续注射12小时后再将50nl生理盐水或LPS注射至此部位,微量注射方法同实验二。空白组大鼠除麻醉外不接受其它任何操作以排除定位注射操作本身对实验结果干扰的可能性。LPS或生理盐水注射结束12小时行RSNA测定,处死大鼠后取材PVN组织,Western blot检测相关蛋白量。取材外周血及心肌组织,ELISA测定NE水平。研究结果1.心梗1天时PVN内TLR4表达即出现升高趋势,至第3天时较健康大鼠已有明显统计学意义的高表达,且至心梗后1周仍有明显高水平。TLR4相关分子NF-κB、NOX2(NAD(P)H氧化酶的重要功能亚基,催化ROS产生)等的表达也可见相似趋势,心梗3-5日达到表达高峰,且长期维持高水平。通过shRNA干扰心梗后PVN组织TLR4表达,NF-κ B、NOX2、IL-1 β和TNF-α含量出现显著降低,可见心梗后NF-κ B介导的炎性通路及ROS的分泌受TLR4的调控。2.心梗后3天,我们通过免疫荧光可见小胶质细胞被激活,表达显著增加,且TLR4与小胶质细胞表面标志Ibal大量共染,说明PVN内TLR4的激活在心梗发展过程中多表达于小胶质细胞。3.心梗后PVN中神经元活性升高,此现象被免疫组化结果证实,而外周血及心肌组织内NE的高分泌则间接说明外周交感神经的高活性。同时,RSNA、72小时持续小动物遥测也揭示了心梗早期交感神经激活这一结论。但当提前抑制TLR4表达后,上述实验结果分析可得PVN内神经元活性及外周交感神经活性均有显著意义的下降,室性心律失常易感性较单纯MI组也有明显下调,可见PVN TLR4参与调控心梗后交感神经的高活性。4.应用LPS注射至PVN,可见NF-κ B相关炎性通路、ROS表达均有明显上升,外周交感神经活性也出现升高;而抑制NF-κ B激活后,ROS产生及促炎性细胞因子的分泌均明显减少,LPS引起的交感神经激活出现部分程度下调,说明TLR4影响交感活性是经由下游NF-κ B相关通路及ROS产生实现的。研究结论我们通过各项相关实验数据分析得出结论,MI后早期PVN内TLR4即可被显著激活,其主要表达于小胶质细胞,我们阻断TLR4表达时PVN神经元和外周交感神经的高活性得到部分缓解,有效降低了 AMI后恶性心律失常的频发,且这一过程可能部分由NF-κ B炎性通路及ROS产生介导。此发现为临床干预AMI并发的恶性心律失常给予新方向。研究背景急性心肌梗死(AMI)后心律失常频发,有75%?95%的病发者会出现室性心律失常,其中20%?25%将猝死于心梗后的室速、室颤,特别是AMI后的3日内。AMI后高频率的室性心律失常事件,成为影响预后的关键因素之一。有研究报道,心肌缺血15分钟,其缺血区域心肌细胞外即可检测出含量升高100倍的儿茶酚胺类物质(包括去甲肾上腺素),AMI后儿茶酚胺高敏将引发心电紊乱及室性心律失常高发。心梗后早期外周血、心脏去甲肾上腺素(NE)即大量增多,交感神经过度激活成为AMI早期室性心律失常高发的重要缘由。探宂心梗早期交感激活的原因受到越来越多关注。大量前人研究证实,心梗后下丘脑室旁核(PVN)炎症反应强烈,参与交感神经激活。而小胶质细胞作为中枢固有免疫细胞,产生炎性因子和神经营养因子,联系炎性反应与神经活动。MI后小胶质细胞参与交感高活性己见报道,而深入的分子机制尚待探索。Mincle受体是一种跨膜模式识别受体(PRR),在中枢神经系统主要表达于小胶质细胞,能够通过其内源性配体SAP130被激活,发挥促炎症作用。Mincle受体可以作为多种非感染性炎症疾病如脑损伤、蛛网膜下腔出血等的炎症启动因子,但其在心梗后的作用尚未深入探宄。IL-1P作为一种关键且常见的促炎性因子,被证实于心梗后在PVN组织内大量产生,并参与交感神经活性增高。近年有文章表明Mincle受体经由髓系细胞参与NLRP3炎性小体的构成及IL-1 P的成熟表达。这一机制是否在心梗后的PVN内发生尚无相关研究。研究目的PVN内Mincle受体是否参与MI后交感神经过度激活,并导致室性心律失常高发尚无直接证据,我们旨在探索这一现象是否存在,Mincle受体于PVN内的主要定位及是否通过NLRP3/IL-1 P这一分子通路发挥作用。研究方法实验一79只心梗模型后存活雄性SD大鼠(50-60天龄,280g左右)被随机分至7组:假手术组、MI后6、12、24小时组及MI后3、5、7天组。Western blot检测Mincle受体、SAP130、NLRP3、IL-ie蛋白表达量。实验二187只大鼠(品质同上)随机分至4组:(1)假手术组+siRNA对照(250pmol/50nl生理盐水);(2)假手术组+Mincle siRNA(250pmol/50nl);(3)心梗组+siRNA对照;(4)心梗组+Mincle siRNA。为保证目的蛋白抑制效果,三条差异序列被同时应用:(1)5’CACCUUAUCCUGGCUAUCAAGUCUA3’;(2)5’GCUCACCU GGUGGUUAUCAACACAU3’;(3)5’CCUGUUUCUUCAGUAUGCCUUGGAU3’。接受PVN微量注射siRNA 24小时后各组行假手术或心梗手术。术后即刻给予小动物遥测,直至下一步RSNA测定时取下装置行心率变异性分析。术后24小时行肾交感神经活性(RSNA)测定,电生理实验验证室性心律失常易感性,取材PVN组织进行免疫组化实验验证小胶质细胞激活状态、免疫荧光实验检测Mincle受体定位、Western blot测定Mincle受体及相关分子蛋白表达量,取外周血及梗死灶周心肌组织行ELISA检测NE水平。实验三112只大鼠被随机分到6组中:(1)空白组(除麻醉外不行其它任何操作)(2)siRNA对照组;(3)脂多糖(LPS)组(每12.5岣LPS溶于50nl盐水中);⑷LPS+重组SAP130(rSAP130,每25ng溶于50nl盐水);(5)LPS+rSAP130+NLRP3 siRNA(250pmol/50nl);(6)LPS+rSAP130+gevokizumab(XOMA052,每10Pg gevokizumab溶于50nl盐水)。PVN微量注射LPS 3小时后给予rSAP130,为保证干扰效果,我们设计了两条NLRP3 siRNA序列?.(1)5’GAUCC UAUUUGMGAGUGU3’;(2)5’GAUCAACCUCUCUACCAGA3’。NLRP3 siRNA在给予LPS刺激一天前被给予,而gevokizumab则在rSAP130注射后即刻给予。6小时后测定RSNA,PVN组织行Western blot测定Ibal、Mincle、NLRP3、IL-1P蛋白表达量,外周血及心肌组织ELISA检测NE水平。研究结果1.心梗6小时即可见Mincle内源性受体SAP130的显著上调,这种上升趋势可持续至MI后24小时,至MI后第3天其表达恢复至基线水平;Mincle受体表达也于MI后12小时出现显著意义的增强,于24小时时达到表达高峰。免疫组化实验证实心梗后PVN小胶质细胞表达增多,而干扰Mincle受体表达后小胶质细胞水平部分减弱,同时NLRP3炎症小体及下游IL-1 0的表达也明显降低。2.MI后PVN Mincle受体的激活主要表达于小胶质细胞,NE水平测定、心率变异性分析、RSNA检测等实验证实MI后交感神经激活,上述实验也表明干预Mincle受体可减低MI后交感兴奋,进而减少室性心律失常易感性。3.同时微量注射LPS+rSAP130时Mincle受体的激活表达较单独应用LPS时明显升高,Mincle受体的激活引起外周交感神经的活性升高。而干扰NLRP3作用发挥或抑制IL-1 P均可减弱Mincle高水平产生的交感激活状态,这说明Mincle的增强交感神经活性作用是通过下游NLRP3/IL-1 0通路发挥的。研究结论我们的研究得出结论,MI后早期PVN内Mincle受体即可被激活,且主要表达于小胶质细胞,参与MI后交感神经激活,从而导致室性心律失常的高发,这一过程部分依赖于下游NLRP3/IL-1 P信号通路的调控,有助于未来临床减少MI后室性心律失常的频发。