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猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratoe syndrome virus,PRRSV)和马动脉炎病毒(Equine arterits virus,EAV)是套氏病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)的重要成员,这两种病毒每年给畜牧业造成巨大经济损失。特异性识别尿嘧啶核糖核苷酸的核酸内切酶(Nidoviral endonuclease specific for U,NendoU)是套氏病毒进化上最保守的非结构蛋白(non-structuralprotein,nsp)之一,在 PRRSV 和 EAV 中为 nsp11。Nsp11 对于病毒基因组复制和亚基因组的合成是必需的,且涉及多个信号通路,如与分裂素和组蛋白相关的蛋白激酶信号通路、细胞周期及DNA复制相关过程。PRRSVnsp11除了 NendoU活力之外,还具有去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)活力,并能通过这两种活力抑制宿主免疫相关因子的正常表达,在病毒免疫逃逸过程中发挥作用。另外,nsp11与其在冠状病毒中的同源蛋白nsp15存在较大差异。目前,关于nsp11还存在很多的问题,如:PRRSV nsp11在抑制宿主免疫系统过程中发挥NendoU活力还是DUB活力,EAV nsp11是否也具有DUB活力以及nsp11与冠状病毒nsp15功能差异的分子机制。为了解决上述问题,本研究采用蛋白质晶体学的方法,从结构出发,来阐明nsp11功能多样的分子基础。本研究首先筛选突变蛋白,解决PRRSV和EAV nsp11野生型蛋白表达量低的问题,随后经过高通量晶体筛选获得PRRSV和EAVnsp11多个活性中心突变蛋白晶体。利用重金属原子(Hg)浸泡法确定相位,系统性地解析了多个动脉炎病毒属nsp11家族蛋白结构。动脉炎病毒nsp11整体结构分为N端结构域和C端结构域两部分,核酸内切酶活性中心位于C端带有正电荷的沟壑处。多个突变蛋白结构表明,所进行的活性位点氨基酸残基突变不影响整体结构;而且同一家族动脉炎病毒NendoU的三维结构、催化活性中心氨基酸残基位置非常保守。结构比较发现,nsp11活性中心非常灵活多变,具有多种构象;结构中分子间相互作用多样,PISA计算结果显示这些相互作用面积小。动脉炎病毒nsp11虽然缺乏类似冠状病毒nsp15介导六聚体形成的结构域,但本研究通过凝胶过滤层析、分析超速离心和X射线小角散射等实验证明PRRSV和EAV nsp11在溶液中同样存在多聚体形式,主要是三聚体和四聚体形成的动态平衡,并具有浓度依赖性;突变蛋白聚集状态与野生型蛋白相同。后续通过结构分析以及相关生化实验证明PRRSV和EAV nsp11是一类具有特殊催化性质的NendoU,催化过程与冠状病毒nsp15差异较大,包括不同的底物识别方式,活性中心参与聚集体的形成,不能稳定结合Mn2+等性质。同时本研究证明nsp11不具备单独去泛素化活力。最后根据结构和生化数据,本研究推测nsp11以独特的方式形成四聚体来发挥催化活性,并提出nsp11发挥活力的机理,即nsp11不结合底物时,处于三聚体形式的非活性状态,此时构象多样;当结合底物时,受底物诱导发生分子重排,形成规则的活性四聚体状态,并将底物结合到两个活性中心,底物水解完成催化过程;此外活性状态的四聚体能够通过两两结合的方式,形成更加高级的聚集形式来提高催化效率。综上所述,本研究解析了高分辨率的PRRSV和EAV nsp11多个突变蛋白晶体结构,结合相关生化实验证实,动脉炎病毒nsp11是一类具有特殊性质的NendoU,从而拓展了对套氏病毒NendoU的认识;从结构生物学的角度更加清晰、全面地阐释了 PRRSV和EAV nsp11催化功能多样性的分子基础,并为针对nsp11的药物开发提供详实的结构信息。