目的：　　 小胶质细胞(Microglia,MI)是中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞,发挥监测脑内异常变化的功能。小胶质细胞对外界环境刺激非常敏感,既可以通过吞噬组织中的病原体及有害颗粒对神经元起到保护作用,也可以通过分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用。有研究证实MI老化后其功能由神经保护向神经损伤转变。老化MI不仅释放的炎症介质显著增多,其对损伤的反应也发生显著改变。这些老化MI并不会迅速死亡而是长期存在于脑内,通过释放炎性介质等持续对多巴胺(Dopamine,DA)神经元生存的微环境施加负面影响,最终导致DA神经元的大量死亡。在帕金森氏病、阿尔兹海默病等衰老相关的神经系统变性病的发生、发展中起着重要作用。　　 细胞衰老可以被多种不同的刺激因素(如氧化应激、损伤、放射、肿瘤蛋白激活、化学诱变剂等)诱导发生,表现为细胞分裂停止或分裂能力下降,并表达一些老化相关的蛋白。癌基因诱导老化(Oncogene-inducedSenescence,OIS)是最常见的病理性老化,这是机体对抗癌症的一种内在保护机制,OIS在细胞受到恶变威胁时引导细胞停止异常增殖,发生老化。癌基因诱导的老化可以保护机体免受恶性肿瘤的侵害,但另一方面老化却是PD的高危因素,即老化减少恶变发生的同时增加了PD的危险,然而大量证据显示PD患者的黑质中恶变倾向和OIS同时并存。因此我们推测帕金森病人脑内的MI为避免恶变的发生通过OIS发生老化,老化的MI不断积累,释放炎症介质,导致脑内微环境的改变,在遭遇其他病理刺激时过度激活,导致或加重DA神经元的损伤。　　 本研究从体外实验考察恶变诱导MI发生老化、老化MI对DA神经元损伤机制、及丁苯酞(3-n-Butylphthalide,NBP)干预的保护作用,为探讨和干预PD发病的微环境机制及寻求神经保护治疗奠定基础。　　 方法：　　 采用原代培养法进行MI的培养;采用细胞株传代法培养PC12,替代神经元细胞。给予致癌剂佛波酯(Phorbol12-myristate13-acetate,PMA)持续刺激小胶质细胞。进行下列相关检测:　　 1、采用细胞化学染色法进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色。　　 2、采用流式细胞仪法进行细胞周期检测。　　 3、采用免疫荧光染色法以共聚焦显微镜观察P53、P21蛋白表达荧光强度。　　 4、采用Westernblot进行衰老相关蛋白P53、P21检测并半定量分析。　　 5、采用免疫荧光染色法和流式细胞仪进行细胞内活性氧(reactiVeoxygenspecies,ROS)检测。　　 6、采用ELISA方法对培养上清中细胞因子进行定量检测。　　 不同剂量的丁苯酞预处理PC12细胞,再加入低剂量鱼藤酮继续培养后,与老化MI建立共育培养系统。分组如下:　　 A、对照组:培养的PC12细胞,未给予任何处理药物　　 B、PC12与老化MI共育　　 C、鱼藤酮损伤PC12后与老化MI共育　　 D、NBP0.01μM预处理PC12细胞+鱼藤酮后与老化MI共育　　 E、NBP0.1μM预处理PC12细胞+鱼藤酮后与老化MI共育　　 F、NBP1μM预处理PC12细胞+鱼藤酮后与老化MI共育　　 G、NBP10μM预处理PC12细胞+鱼藤酮后与老化MI共育　　 H、NBP100μM预处理PC12细胞+鱼藤酮后与老化MI共育　　 1、倒置显微镜下观察PC12细胞形态变化。　　 2、采用JC-1标记法以流式细胞仪对PC12线粒体膜电位进行定量检测。　　 3、采用AnnexinV-PI双染法以流式细胞仪对PC12凋亡进行定量检测。　　 4、采用流式细胞仪对PC12细胞内活性氧检测。　　 所有数据以-X±S表示,应用SPSS13.0软件进行统计分析,多组资料用One-WayANOVA方法进行比较。以P＜0.05或P＜0.01为标准认为存在显著性差异。　　 结果：　　 1、β-半乳糖苷酶染色结果显示,对照组几乎不表达β-半乳糖苷酶蓝染细胞;PMA刺激小胶质细胞组蓝染阳性细胞数明显增加,且随PMA刺激持续时间的延长蓝染阳性细胞数增加越明显。　　 2、流式细胞分析结果可见与对照组比较,PMA组细胞周期多停滞于G0/G1期,S期明显减少,并且随着PMA刺激持续时间的延长G0/G1期细胞比例逐渐增加,S期比例相应减少;实验组与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05)。　　 3、Western印迹法检测各组p53及p21蛋白表达的情况并用β-actin进行校正。结果显示对照组仅表达微量的p53、p21蛋白。与对照组比较,PMA组p53及p21蛋白呈时间依赖性地上调表达。PMA刺激MI在24h时p21蛋白质表达逐渐增高(P＜0.05);p53蛋白呈时间依赖性地上调表达,但PMA刺激MI48h时才出现p53蛋白质表达逐渐增高,72h时p53蛋白质表达至高峰(P＜0.01)。荧光显微镜下见p21及p53蛋白呈红色荧光,同Western检测结果相一致。　　 4、ROS生成水平显示PMA处理组的MI较对照组显著提高,在24h、48h、72h3个时点分别比对照组增高,与Control组相比有明显差异(P＜0.01),而且荧光强度呈时间依赖性,PMA72小时最明显。　　 5、ELISA法检测TNF-α和IL-1β在PMA刺激小胶质细胞48h时与对照组相比有统计学差异,72h时统计学差异更明显(P＜0.01)。　　 6、倒置显微镜下观察空白对照组分化期PC12细胞,胞体呈梭形或者三角形贴壁生长,B组和C组细胞形态变得不规则,突起结构逐渐消失或者变短,细胞体积逐渐变小,变圆。NBP预处理组细胞生长形态变化明显小于C组。　　 7、流式细胞仪法检测B组细胞凋亡率增高,同时细胞内ROS生成增多,线粒体膜电位下降。更为显著的是C组这些变化进一步加重,与空白对照组相比均有统计学差异。而且0.01～100μM的NBP预处理组均可不同程度地抑制这一变化,呈现良好的量效关系。　　 结论：　　 1、致癌物佛波酯可诱导MI发生老化,随着诱导时间延长,MI老化的程度不断增加。　　 2、老化的小胶质细胞进行多种生物活动,分泌各种炎性介质等持续对周围微环境施加负面影响。当再次遭受刺激时炎症失控,导致DA神经元的大量死亡。　　 3、丁苯酞可能通过抗细胞凋亡、保护线粒体功能、清楚氧自由基等机制对损伤后神经元起保护作用。