目的:2型糖尿病(T2D)的诱因有多种,其中肥胖(obesity)尤其是腹部肥胖(内脏肥胖)被警示为2型糖尿病的高危因素。之所以存在这种相关性,是因为肥胖和T2D的机体均处于慢性低度代谢性炎症状态。肥胖患者的胰岛素靶组织(肝脏、肌肉和脂肪等)内存在大量免疫细胞聚集,特别是M1样巨噬细胞,分泌半乳凝集素3(Galectin3,Gal3)、IL-6、IL-1β和TNF-α等致炎因子,上述致炎因子会作用于胰岛素信号通路,阻碍胰岛素信号向下传导以致严重的胰岛素抵抗,最终形成2型糖尿病。胡椒碱(Piperine)是从植物黑胡椒果实中分离得到的一种天然生物碱,在全世界拥有悠久的食用历史。有研究指出,胡椒碱对高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠具有一定的治疗作用,但其作用机制并不明确。近年来研究证实胡椒碱在多种慢性炎症性疾病模型中具有良好的治疗作用,基于慢性炎症在肥胖导致2型糖尿病的病理进程中所扮演的重要角色,本课题旨在探讨胡椒碱是否可以通过抑制代谢性炎症从而对肥胖的2型糖尿病起到一定的治疗作用,并进行作用机制的研究。方法:(1)动物实验。新出生第2天的ICR乳鼠皮下注射剂量为4 g/kg体重的谷氨酸钠(MSG)溶液,诱导形成肥胖的2型糖尿病小鼠模型并动态监测模型诱导的过程中MSG小鼠肥胖进展程度及糖脂代谢情况,以评价模型诱导是否成功。正常饲养6个月后,将雄性MSG肥胖小鼠随机分为以下三组:模型对照组,阳性药二甲双胍组(150 mg/kg/d)和胡椒碱组(40 mg/kg/d)。以6月龄正常雄性ICR小鼠作为正常对照组,每组小鼠10只。采用灌胃方式给予胡椒碱组和二甲双胍组小鼠相应剂量的药物,模型组和正常组小鼠给予等量的0.5%CMC-Na溶液,连续给药10周。给药结束后,检测各组小鼠的体重,Lee’s指数以及脏器指数以评价胡椒碱对MSG小鼠肥胖程度的影响;检测血液中的糖脂代谢相关指标的变化来评价胡椒碱对MSG肥胖小鼠糖脂代谢紊乱的作用;通过口服糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT)以评价胡椒碱对MSG肥胖小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的影响;进行高葡萄糖钳夹实验考察胡椒碱对MSG肥胖小鼠胰岛β细胞功能的影响;通过血常规检测评价胡椒碱对MSG小鼠血液免疫相关细胞数量的影响;采用Elisa方法检测小鼠血清致炎因子水平,以及q PCR实验检测各组小鼠内脏脂肪组织中相应致炎因子m RNA水平以评价胡椒碱对MSG肥胖小鼠慢性代谢性炎症的抑制作用;采用免疫组化检测内脏脂肪组织中CD11c的蛋白表达以评价胡椒碱对脂肪组织巨噬细胞M1样极化的影响;同时进行HE染色实验检测胡椒碱对肝脏,胰腺和脂肪组织病理形态学的影响。(2)细胞实验。为了检测胡椒碱对炎症性巨噬细胞的抑制作用,首先,应用不同浓度(20、40、80μM)胡椒碱预处理RAW264.7巨噬细胞细胞12 h,然后采用LPS溶液(1μg/m L)刺激24 h,使细胞发生M1样极化,建立炎症性巨噬细胞;采用Elisa方法检测细胞上清液炎症因子IL-1β的含量;通过q PCR实验检测巨噬细胞M1样极化标志物CD11c和致炎因子IL-1β、TNF-α在m RNA水平的表达情况;通过WB实验检测TLR-4、CD11c及IL-1β在蛋白水平的变化。结果:(1)动物实验。通过动态监测MSG小鼠在模型诱导过程中肥胖程度及糖脂代谢指标变化,发现到6月龄时,肥胖的2型糖尿病小鼠模型诱导成功。给药过程中对各组小鼠肥胖程度进行监测,结果显示,胡椒碱在不影响摄食量的情况下能够抑制MSG小鼠体重增长并降低腹脂指数,减轻肠系膜脂肪异位堆积,说明胡椒碱对MSG肥胖小鼠具有较强的降脂减重作用。给药结束后发现,胡椒碱不仅可以显著降低MSG肥胖小鼠的空腹血糖(FBG),血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平,而且还可以改善口服葡萄糖不耐受和外周胰岛素抵抗状态,并在一定程度上降低了血清中的胰岛素含量,减轻了高胰岛素血症。此外,血常规结果表明,胡椒碱降低了MSG肥胖小鼠血液中与炎症相关的白细胞(WBC)的数量,Elisa实验结果与之相似,胡椒碱降低了MSG肥胖小鼠血清中LPS、IL-1β和Gal-3等致炎因子的水平。再次,HE染色实验证实了胡椒碱减轻了MSG肥胖小鼠肝脏组织中的白色脂肪浸润,减小了内脏脂肪细胞直径,并且改善了胰岛病理形态学变化。最后,q PCR结果提示胡椒碱显著降低了肥胖小鼠内脏脂肪组织中相关致炎因子在m RNA水平的表达,与此结果相吻合,免疫组化实验结果也进一步证明,胡椒碱能够降低巨噬细胞M1样极化标志物CD11c蛋白水平的表达,抑制脂肪组织巨噬细胞发生M1样极化程度。上述实验结果在动物水平验证了本课题的实验假说,即胡椒碱通过抑制内脏脂肪巨噬细胞M1样极化,减轻局部及全身慢性代谢性炎症程度,改善肥胖MSG小鼠的胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱,从而产生抗肥胖相关糖尿病的作用。(2)细胞实验。q PCR实验结果表明,胡椒碱能够显著降低LPS刺激的炎症性巨噬细胞致炎因子(IL-1β、TNF-α)的转录水平,并呈现出良好剂量依赖性。同时,Elisa实验显示,随着胡椒碱浓度的升高,细胞上清液中的IL-1β含量逐渐降低。最后,WB实验结果表明,胡椒碱能够显著下调M1样极化标志物CD11c,IL-1β和TLR-4的蛋白表达。上述实验在细胞水平证明了胡椒碱对LPS诱导的巨噬细胞M1样极化具有抑制作用,结果与整体动物实验部分相吻合。结论:综上所述,胡椒碱能够明显延缓肥胖相关糖尿病的进展程度,调控其严重的糖脂代谢紊乱、口服葡萄糖不耐受及胰岛素抵抗状态,此作用的发生是基于胡椒碱对内脏脂肪中巨噬细胞M1样极化状态的抑制,很可能还干预了内脏脂肪细胞与巨噬细胞间的恶性诱导,从而在很大程度上降低了内脏脂肪及全身的代谢性炎症状态。食用香料胡椒是胡椒碱的重要来源之一,二者是安全且有效的,因而胡椒碱有希望作为膳食调节剂或药物用于肥胖相关糖尿病的防治。