新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)成员,是一种有囊膜、含有单股负链不分节段基因组的RNA病毒,其基因组大小约为15kb,至少编码6种病毒蛋白。其中,M蛋白是NDV编码的病毒蛋白中含量最为丰富且高度保守的非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成病毒内膜与核衣壳蛋白连接的支架。同其它副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白也是一个细胞核-细胞质穿梭蛋白。在病毒感染早期,M蛋白大量聚集在细胞核和核仁中,并且在整个感染过程中持续存在于核仁中,其主要功能是抑制宿主细胞基因的转录和翻译,并保证病毒基因组在细胞质中有足够的时间进行复制和转录；而在感染后期,M蛋白则进入细胞质,在细胞膜内侧通过与细胞膜、病毒核衣壳蛋白以及糖蛋白的胞质区相互作用,协助子代病毒粒子进行装配和释放。因此,M蛋白是一种多功能病毒蛋白,在病毒的整个生活周期中发挥了重要的作用。尽管如此,目前对M蛋白在NDV复制中的作用还有许多未知的地方,大部分数据来自于对其它副黏病毒M蛋白的研究成果。本研究以鉴定NDV M蛋白功能结构域、探索M蛋白功能结构域突变以及M蛋白与细胞蛋白相互作用影响病毒复制的分子机制为研究口的,为进一步阐明M蛋白在NDV复制中的作用奠定基础。1.新城疫病毒M蛋白核输出信号的鉴定本研究首先将NDV M蛋白基因插入到真核表达载体pEGFP-C1中,在细胞内表达GFP-M融合蛋白,建立绿色荧光蛋白标记的方法观察NDV M蛋白的亚细胞定位。结果表明,该方法与NDV感染细胞后用间接免疫荧光方法得到的结果一致,可以用于NDV M蛋白亚细胞定位的研究。另外,我们将NDV F48E8株M蛋白氨基酸序列与其它已报道的蛋白核输出信号(NES)序列进行比对,发现11个假定的NES。将假定的M蛋白NES与GFP进行融合表达,转染细胞后经过药物环己酰亚胺筛选,共鉴定出3个功能性NES。对M蛋白NES核输出活性测定,结果发现3个NES核输出活性高低不同,其中M-NES1核输出活性较强(为4+),而M-NES2和M-NES3核输出活性较弱(为2+)。同时,对M蛋白NES中关键疏水性氨基酸的鉴定结果表明,3个NES的最后2个疏水性氨基酸在NES介导的核输出能力中起关键作用,而且这些关键氨基酸在不同基因型NDV M蛋白中均保守。此外,将M蛋白NES进行单个或联合突变,发现单个或2个NES联合突变不影响M蛋白细胞质定位,而3个NES联合突变则导致M蛋白由细胞质定位变为细胞核定位。在此过程中,使用出核转运抑制剂Leptomycin B均不影响NES突变前后M蛋白亚细胞定位。我们的结果说明,NDV M蛋白中存在3个NES共同决定M蛋白的细胞质定位,而且3个NES介导的M蛋白核输出途径是CRM1非依赖的。2.新城疫病毒M蛋白FPIV晚期结构域突变影响病毒的复制和出芽本研究根据其它副黏病毒M蛋白中已报道的晚期结构域,将NDV ZJ1株M蛋白氨基酸序列与之进行比对分析,发现NDV M蛋白中存在与人副流感病毒5型和腮腺炎病毒M蛋白相似的FPIV晚期结构域。以NDV ZJ1株全长cDNA克隆质粒pNDV/ZJ1为骨架构建M蛋白点突变全长质粒,利用反向遗传学技术,我们成功拯救出FPIV点突变的四株病毒。病毒在鸡胚和细胞中的复制能力测定结果显示,四株突变病毒能在鸡胚中稳定繁殖,但F或P突变的病毒在鸡胚和细胞中的复制能力显著下降。同时,病毒生物学特性测定结果表明,F或P突变导致病毒的MDT(分别为102h和84h)与亲本病毒(54h)相比明显延长,并且ICPI测定值(分别为1.64和1.70)与亲本病毒(1.89)相比也明显下降,说明F或P突变能降低病毒的复制能力和致病性。此外,病毒出芽效率测定结果显示,F或P突变导致病毒在DF-1细胞中的出芽效率显著降低,而且影响M蛋白与病毒出芽相关细胞蛋白VPS4A的结合。我们的结果说明,NDV M蛋白中的FPIV基序是病毒出芽必需的晚期结构域,而FPIV晚期结构域中的氨基酸F和P对病毒复制、致病力以及出芽过程起关键作用。同时,NDV的出芽过程需要依赖宿主细胞内多泡体蛋白分选途径。3.新城疫病毒M蛋白R42A突变影响M蛋白细胞核定位并且降低病毒的复制和致病性NDV M蛋白是一种具有高度碱性、疏水性但不跨膜的病毒蛋白。对M蛋白电荷分布分析发现,M蛋白N-端前100位氨基酸总体呈酸性,仅含有个别碱性氨基酸。本研究对NDV ZJ1株M蛋白N-端前100位氨基酸中的碱性氨基酸进行突变,以观察点突变对M蛋白亚细胞定位的影响,并通过反向遗传学技术拯救点突变病毒,进一步研究突变对病毒复制和致病性的影响。结果显示,M蛋白第42位碱性氨基酸R突变为A后,导致M蛋白由细胞核和核仁定位变为细胞质定位,但是不影响M蛋白与病毒NP蛋白和HN蛋白的相互作用。将NDV与其它副黏病毒M蛋白氨基酸序列进行比较,发现NDV M蛋白第42位R在所有副黏病毒M蛋白中均保守。以表达绿色荧光蛋白的NDV ZJ1株全长cDNA克隆质粒pNDV/ZJ1GFP为骨架构建M蛋白R42A点突变全长质粒pNDV/ZJ1GFP-M/R42A,利用反向遗传学技术,我们成拯救出突变病毒rZJ1GFP-M/R42A。生物学特性测定结果显示,M蛋白R42A突变导致病毒的MDT(115h)与亲本病毒(52h)相比明显延长,并且突变病毒的ICPI和IVPI值明显下降。同时,突变病毒在细胞中的增殖能力和空斑形成能力显著下降,说明R42A突变降低了病毒的复制能力和致病性。此外,动物实验结果显示,R42A突变导致病毒rZJ1GFP-M/R42A感染鸡后产生的临床症状减轻以及病毒在鸡组织脏器中的复制水平明显降低。我们的研究结果表明M蛋白R42A突变通过影响M蛋白的细胞核定位,从而降低病毒的复制能力和致病性。4.新城疫病毒M蛋白与细胞核磷蛋白B23相互作用促进病毒的复制本研究首先利用酵母双杂交方法鉴定与NDV M蛋白相互作用的细胞核仁蛋白,结果显示M蛋白与细胞核磷蛋白B23存在相互作用,并且这种相互作用进一步通过GSTPull-down和免疫共沉淀方法得到验证。M蛋白与B23蛋白荧光共定位结果表明,在病毒感染早期,M蛋白与B23蛋白在核仁具有明显的共定位,而在病毒感染后期,M蛋白在鸳胞核和细胞质都存在,但B23蛋白由核仁定位变为核质定位。通过Pull-down方法对两者相互作用结构域进一步鉴定,发现M蛋白aa30-60与B23蛋白aal88-245是相互作用区域。为了探索B23蛋白在M蛋白亚细胞定位以及对病毒复制的作用,我们用RNA干扰方法降低细胞内B23蛋白表达水平,结果发现,抑制B23蛋白表达减少了M蛋白在细胞核仁中的定位,而且明显减弱了病毒感染细胞产生的细胞病变和降低了病毒的复制效率。此外,在细胞内过表达与M蛋白相互作用的B23蛋白或B23蛋白结构域,均影响了M蛋白的正常细胞定位以及降低了病毒的复制。我们的研究结果说明,B23蛋白促进NDV的复制是通过M-B23相互作用,介导M蛋白的核仁定位引起的。另外,NDV感染细胞后可能通过M蛋白在核仁中破坏B23蛋白的结构与功能,进而增强病毒的复制能力。