研究背景胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,具有高侵袭、高复发和易产生耐药性等特点。手术结合放疗、化疗的综合治疗模式是恶性胶质瘤治疗的主要方案,低级别胶质瘤仍以手术治疗为主。化疗尤其对于治疗晚期胶质瘤以及减少复发具有重要意义,但是化疗对于主要为实体瘤的胶质瘤来说,疗效仍无法令人满意。因此,寻找特异性强、低毒高效的新型抗肿瘤药物,是抗胶质瘤研究领域的热点。NF-κB在肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用,研究证实,NF-κB在多种实体恶性肿瘤中表达水平均显著增加,例如非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌以及胶质瘤等,其作用与抑制癌细胞凋亡、促进侵袭转移等方面密切相关。NF-κB及其信号通路的激活在多种肿瘤细胞中都处于持续性状态,包括造血系统肿瘤和实体肿瘤,被认为是多种恶性肿瘤发病的关键机制之一。胶质瘤细胞中NF-κB通路的激活状态并非一成不变,而是受到多种体内和体外因素的共同作用。目前,针对NF-κB通路抑制剂的研发虽有成效但仍然需要进行更深层次的研究,仍需要继续探索NF-κB通路抑制剂在胶质瘤发生发展中的作用及相关治疗的作用机制。本课题在前期高通量药物筛选的基础上,拟通过观察NF-κB抑制剂对人脑胶质瘤细胞株和人原代胶质瘤细胞增殖、凋亡的作用,从细胞分子生物学水平揭示NF-κB抑制剂抑制胶质瘤恶性生物学行为的作用及其机制。最后,将采用原位移植瘤动物模型检验NF-κB抑制剂的抗胶质瘤作用,揭示NF-κB抑制剂在体内对胶质瘤的治疗作用,从而为NF-κB抑制剂的临床应用转化提供实验依据。研究内容(1)采用了人胶质瘤细胞系U87,通过Target Selective Inhibitor Library对464种化合物的抗胶质瘤活性进行筛选,并对其抗胶质瘤活性进行实验鉴定;(2)采用NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A作为研究对象,采用人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞作为研究模型;(3)采用CCK-8检测NF-κB抑制剂对胶质瘤细胞活力的影响,采用Brdu法检测胶质瘤细胞增殖能力,采用Hoechst33342染色试剂和TUNEL法检测胶质瘤细胞的凋亡水平;(4)采用Realtime PCR和Western blot检测胶质瘤细胞中目标基因的mRNA和蛋白表达水平;(5)采用ELISA法检测NF-κB抑制剂对TNF-α因子浓度的影响,采用试剂盒检测胶质瘤细胞中Caspase-3/7活性;(6)采用裸鼠的脑胶质瘤原位移植瘤模型探索在在体条件下NF-κB抑制剂CAPE对人胶质瘤细胞U87增殖和凋亡的作用,以及对肿瘤体积、肿瘤细胞形态、裸鼠生存率的影响,同时检测裸鼠胶质瘤组织中TNF-α因子浓度、Caspase-3/7活性、p65 NF-κB的磷酸化水平。研究结果(1)经过初步筛选,将Target Selective Inhibitor Library中的464种候选药物作用于U87细胞后之间的差异通过细胞活力以不同的颜色在热点图(Hit map)里进行区分,根据热点图1所示,抑制U87细胞活力的前5种化学物质为CAPE(细胞活力=0.161)、Cryptotanshinone(细胞活力=0.191)、PF-5274857(细胞活力=0.197)、Pifithrin-μ(细胞活力=0.201)和Tenovin-6(细胞活力=0.202)。CAPE是一种NF-κB抑制剂,另外两种NF-κB抑制剂JSH-23(细胞活力=0.271)和S4-A(细胞活力=0.252)也显著抑制U87细胞活力。为了进一步验证高通量筛选结果,我们进一步采用了人胶质瘤细胞系U87,人胶质瘤细胞系M059K以及人胶质瘤细胞系U251和人原代胶质瘤细胞,验证NF-κB抑制剂对其细胞活力的影响,CCK-8的检测结果如图2显示,经过不同NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A分别处理后的人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞,细胞活力均出现了显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)使用不同NF-κB抑制剂处理人胶质瘤细胞24h后,CCK-8的检测结果显示,NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A均能够显著抑制人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞的细胞活力,结果均具有显著性差异(p<0.05),其中CAPE对U87细胞增殖的抑制作用最显著。Brdu法检测结果显示,NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A均能够显著抑制人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞的增殖能力,结果均具有显著性差异(p<0.05),其中CAPE对U87细胞增殖的抑制作用最显著。Hoechst染色结果显示,空白对照组的胶质瘤细胞经Hoechst染色后发出蓝色荧光,形态表现为圆形或椭圆形,而经过不同NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A分别处理后的人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞均出现了显著的细胞核形态改变,表现为核固缩、核凝结、染色质碎裂,染色团块聚集紧密、荧光增强并且出现凋亡小体等改变,表明NF-κB抑制剂促进人胶质瘤细胞的凋亡。TUNEL检测结果显示,经过NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A分别处理后的人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞的凋亡比例均出现显著增加,其中CAPE处理U87细胞后凋亡比例最高。(3)使用不同NF-κB抑制剂处理人胶质瘤细胞24h后,检测结果显示,NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A均能够显著抑制人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251中TNF-αmRNA的合成以及TNF-α因子的释放,PCR的检测结果与ELISA检测结果趋势一致,均具有显著性差异(p<0.05)。NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A均能够显著促进人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞中Caspase-3/7的激活,均具有显著性差异(p<0.05)。NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A均能够显著抑制人胶质瘤细胞系U87,M059K和U251以及人原代胶质瘤细胞中p65 NF-κB的磷酸化,均具有显著性差异(p<0.05)。而对STAT1的磷酸化水平无影响。(4)对照组的裸鼠在接种人胶质瘤U87细胞后,肿瘤生长速度快,NF-κB抑制剂CAPE组的裸鼠生长速度相对缓慢,从第14天开始,两组裸鼠的胶质瘤体积有显著差异(p<0.05),并且随着接种时间的延长,两组裸鼠的胶质瘤体积差异也逐渐增大。在接种4周后,对照组裸鼠胶质瘤体积为251.3±41.4mm~3,CAPE组体积仅为91.3±9.36mm~3。接种胶质瘤细胞后,对照组裸鼠从第16天开始出现死亡,CAPE组裸鼠从第18天开始出现死亡,至第28天,对照组裸鼠生存率降低至0%,CAPE组裸鼠的生存率为50%,差异具有统计学意义(p<0.01)。组织病理学检测结果显示,对照组裸鼠的胶质瘤细胞丰富密集,形态正常,细胞凋亡数量少,而CAPE组裸鼠的胶质瘤细胞密度相对减少,部分细胞形态异常,出现核固缩等凋亡的形态学改变,部分组织可见坏死。U87细胞接种裸鼠第28天后,NF-κB抑制剂CAPE组裸鼠的胶质瘤组织中TNF-α浓度为412.5±52.3pg/ml,显著低于对照组裸鼠(p<0.05);CAPE组裸鼠的Caspase-3/7的蛋白活性增长显著升高至451.2±61.9%,显著高于对照组裸鼠(p<0.01);CAPE组裸鼠的p65 NF-κB的磷酸化水平增长显著低于对照组裸鼠(p<0.05)。研究结论(1)经过高通量筛选得到的NF-κB抑制剂CAPE、JSH-23、S4-A均能显著抑制多种人胶质瘤细胞的增殖,并促进人胶质瘤细胞的凋亡,揭示了NF-κB抑制剂对人胶质瘤细胞恶性生物学行为特征的抑制作用,为后续研究提供了实验基础。(2)NF-κB抑制剂能够抑制人胶质瘤细胞p65NF-κB的活化,从而减少TNF-α的释放和增强Caspase-3/7的激活,最终抑制人胶质瘤细胞的增殖并促进其凋亡水平。(3)CAPE能显著抑制裸鼠体内胶质瘤的肿瘤体积,诱导胶质瘤细胞凋亡,其作用与抑制TNF-α因子释放,促进Caspase-3/7活化,抑制NF-κB通路激活等相关,表明NF-κB抑制剂CAPE具有体内抗恶性胶质瘤作用,有望为其临床应用的转化提供实验证据。