表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)的治疗能显著延长存在EGFR突变的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的存活时间。吉非替尼(Gefitinib)是全球最早进入临床的EGFR-TKIs,2003年被FDA批准作为NSCLC的三线治疗药物,2005年获中国食品药品监督管理局批准用于治疗既往接受过化疗的局部晚期或转移性NSCLC患者,然而,部分患者对Gefitinib原发耐药。Fox O3a作为叉头蛋白家族的转录因子可以参与细胞中的多种生理生化活动进程,但其在原发性EGFR-TKIs耐药及调控肿瘤增殖方面的机制尚不明确。生长因子调控包括增殖,分化和代谢等在内的一系列细胞生命进程。通过与配体结合,生长因子受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)的内在催化活性激活。通过自身磷酸化并磷酸化细胞内底物使生长信号传递到胞内。因此,识别和鉴定被RTKs酪氨酰磷酸化的蛋白质是阐明RTKs介导的信号通路的关键。在这里,我们研究表皮生长因子受体通路底物8(EGFR pathway substrate 8,EPS8)并探究其与Fox O3a的相互作用关系,讨论其生物学功能以及对NSCLC耐药,增殖和转移的影响,为临床解决Gefitinib耐药问题提供新的治疗策略,并为此提供实验数据支持。目的通过动物模型和细胞模型,使用基因沉默和过表达等分子生物学方法,系统研究Fox O3a和EPS8对NSCLC细胞耐药,增殖及转移的影响。阐明二者在抑制EGFR-TKIs原发耐药中的地位,并探讨EPS8作为抗癌治疗新靶标在临床治疗中所发挥的重要作用。方法1.Fox O3a在NSCLC患者中的表达荧光原位杂交(FISH)检测75例NSCLC患者EGFR的突变类型。同时,对该75例患者的组织芯片进行免疫组化染色,检测Fox O3a的表达程度。2.Fox O3a对PC9细胞耐药性的影响为了体外验证Fox O3a对EGFR-TKIs耐药性的影响,我们通过脂质体转染法将Fox O3a过表达和沉默,通过MTT法检测NSCLC细胞株对Gefitinib的敏感性,绘制抑制曲线并计算IC50。3.体外探究Fox O3a与EPS8的关系为了研究Fox O3a的调控机制,我们采用Western Blot检测与肿瘤耐药、周期、凋亡及转移等活动密切相关的蛋白EPS8,CD31,CD44,Cyclin D1以及Bcl-2的改变情况。同时为了验证Fox O3a和EPS8之间的关系,我们通过RT-PCR检测Fox O3a过表达后EPS8的m RNA含量变化。4.EPS8对PC9细胞耐药性的影响我们通过Western blot检测PC9和A549细胞中Fox O3a和EPS8的蛋白表达情况,并通过MTT法对EPS8过表达和沉默后的PC9细胞株的Gefitinib敏感性进行检测。5.Fox O3a和EPS8对PC9细胞迁移侵袭的影响脂质体转染将Fox O3a和EPS8分别过表达和沉默后,通过Transwell细胞迁移侵袭模型检测两种基因改变前后PC9细胞的迁移和侵袭能力改变。6.Fox O3a和EPS8对PC9细胞凋亡及周期的影响将Fox O3a和EPS8分别过表达和沉默后,采用Annexin V-7AAD/PE两种荧光染料双染(细胞凋亡)或PI单染(细胞周期),流式细胞仪488 nm波长处检测两种基因改变前后对PC9细胞早期和晚期凋亡的改变。7.Fox O3a和EPS8对BALB/c裸鼠肿瘤生长的影响为了研究Fox O3a及EPS8在体内环境中对肿瘤增殖的影响,我们分别将Fox O3a和EPS8过表达和沉默后,调整细胞浓度为2×107个/ml,于六周龄BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下注射,每只注射0.1 ml,每组6只。从注射第6天起,每隔三天用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长径和短径,活体裸鼠肿瘤体积计算公式=1/2(短径2×长径)。21天后处死裸鼠,剥离肿瘤称重。8.临床验证Fox O3a和EPS8的相关性我们分别通过体外实验和动物实验探究Fox O3a和EPS8两者的生物学功能及可能存在的相互作用关系后,再次对75例NSCLC患者的空白组织芯片进行EPS8蛋白免疫组化染色,探究临床上EPS8和Fox O3a表达的相关性及二者在癌与癌旁中的表达差异。9.体外探究Fox O3a对EPS8的调控作用我们为深入探究转录因子Fox O3a调控EPS8的具体作用机制,首先在NCBI网站查询出EPS8基因2000 bp长度的启动子区,然后通过http://jaspar.genereg.net/网站预测Fox O3a在EPS8启动子区上可能存在的结合位点。随后设计相应RT-PCR引物,使扩增产物包含预测的结合序列。通过双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀方法检测Fox O3a是否通过直接结合EPS8的核心启动子区而发挥转录调控作用。结果1.Fox O3a的高表达与EGFR-TKIs敏感性有关NSCLC患者中Fox O3a的细胞核染色强度较细胞质染色更强。EGFR-TKIs未突变组(n=42)的Fox O3a高表达比例为12%,而EGFR-TKIs突变组(n=33)中Fox O3a高表达比例为36%,差异具有统计学意义(P<0.001)。作为ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼的作用靶点,ALK阳性突变与EGFR-TKIs耐药并无统计学意义(P=0.138)。2.Fox O3a增加PC9细胞对Gefitinib的敏感性与对照组(IC50=68.04±3.25 n M)相比,Fox O3a过表达增强了Gefitinib对PC9细胞的生长抑制(IC50=22.69±1.33 n M),P<0.05。Fox O3a沉默减弱了Gefitinib对PC9细胞的生长抑制(IC50=286.14±11.03 n M),P<0.01。3.Fox O3a负性调控EPS8的表达我们通过Western blot检测Fox O3a分别过表达和沉默后,检测与肿瘤发生发展密切相关的CD31、CD44、Cyclin D1和Bcl-2以及EPS8的蛋白含量变化。结果显示,Fox O3a过表达后EPS8的蛋白表达下降(P<0.05);Fox O3a沉默后EPS8的蛋白表达显著升高(P<0.01)。通过转染高表达Fox O3a的质粒,RT-PCR检测发现Fox O3a m RNA的过表达显著抑制了EPS8 m RNA的表达(P<0.05),4.EPS8降低NSCLC细胞对Gefitinib的敏感性Western blot检测发现,A549细胞中Fox O3a的相对蛋白含量低于PC9细胞(P<0.05);而与PC9细胞相比,EPS8在A549细胞中蛋白表达更高(P<0.05)。MTT检测发现,与对照组相比(IC50=68.04±3.25 n M),EPS8的过表达显著抑制了PC9细胞对Gefitinib的敏感性(IC50=387.33±20.74 n M),P<0.05;EPS8沉默后显著提高了PC9细胞对Gefitinib的敏感性(IC50=15.93±2.60 n M),P<0.05。5.过表达和沉默Fox O3a及EPS8对PC9细胞迁移侵袭的影响Transwell迁移实验中,与对照组264±12个迁移细胞数相比,EPS8过表达后迁移细胞数增加到391±23个;Fox O3a过表达后迁移细胞数减少到123±8个(P<0.05)。EPS8沉默后迁移细胞数减少到69个;Fox O3a沉默后迁移细胞数增加到213个(P<0.01)。Transwell侵袭实验中,与对照组111±9个细胞数相比,EPS8过表达后迁移细胞数增加到220±36个;Fox O3a过表达后侵袭细胞数减少到79±4个(P<0.05)。EPS8沉默后迁移细胞数减少到57±6个;Fox O3a沉默后迁移细胞数增加到152±14个(P<0.01)。6.过表达和沉默Fox O3a及EPS8对PC9细胞凋亡、周期的影响经流式细胞凋亡检测发现,Fox O3a过表达和EPS8沉默后,PC9细胞的早、晚期凋亡比例从原来的8.59%分别上升到12%和22.6%;Fox O3a沉默和EPS8过表达时,PC9细胞的早、晚期凋亡比例较原来的8.59%分别下降至6.05%和4.92%。经流式细胞周期检测发现,Fox O3a过表达和EPS8沉默后,PC9细胞的增殖指数PI从原来的47.31%分别下降到24.76%和37.56%;Fox O3a沉默和EPS8过表达时,PC9细胞的PI较原来的47.31%分别上升至56.4%和57.71%。7.过表达和沉默Fox O3a及EPS8对BALB/c裸鼠肿瘤生长的影响经皮下注射Fox O3a及EPS8分别高表达和沉默的PC9细胞,饲养21天后,检测肿瘤体积。结果发现,与对照组(380±25mm3)相比,si-Fox O3a组和EPS8组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著增加(541±62 mm3,P<0.05;826±82 mm3,P<0.01);Fox O3a组和si-EPS8组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著降低(216±18mm3,P<0.05;249±35mm3,P<0.01)。剥离荷瘤称重发现,与对照组(0.28±0.04g)相比,si-Fox O3a组和EPS8组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著增加(0.37±0.06g,P<0.01;0.58±0.11g,P<0.01);Fox O3a组和si-EPS8组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著降低(0.10±0.02g,P<0.01;0.18±0.03g,P<0.01)。8.临床验证Fox O3a和EPS8的负相关关系免疫组化染色发现,EPS8主要为胞浆表达。在33例EGFR-TKIs突变患者中EPS8高表达患者有8例,占比24%;42例EGFR-TKIs未突变患者中EPS8高表达患者有24例,占比57%(P<0.001)。在58例Fox O3a低表达患者中发现EPS8高表达者为27例(47%),在17例Fox O3a高表达患者中EPS8高表达患者为5例(29%),P<0.01。我们通过对每例患者癌与癌旁的Fox O3a和EPS8表达情况进行比较,发现患者癌组织/癌旁组织中Fox O3a的H-score评分分别为32/88;EPS8的H-score评分分别为104/69,差异均具有统计学意义(P<0.0001)。9.Fox O3a直接调控EPS8的表达通过双荧光素酶报告基因发现EPS8启动子区-837~-382片段是其核心区域。随后在染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)中,我们在这段核心区中的预测结合位点附近设计EPS8扩增引物。Ch IP发现EPS8引物组中Fox O3a/Ig G的富集倍数为8.9倍,差异具有统计学意义。结果说明,转录因子Fox O3a直接结合EPS8核心启动子区中的CAGTTTAC序列而发挥对后者的转录负调控作用。结论1.Fox O3a在EGFR突变的NSCLC患者中高表达;EPS8在EGFR突变的NSCLC患者中低表达,且与Fox O3a的表达呈负相关。2.Fox O3a在癌组织中的表达低于癌旁组织;EPS8在癌组织中的表达高于癌旁组织。3.Fox O3a增强了PC9细胞对Gefitinib的敏感性;EPS8降低了PC9细胞对Gefitinib的敏感性。4.Fox O3a能够抑制PC9细胞的迁移和侵袭,促进细胞凋亡并引起细胞周期阻滞;EPS8可以促进PC9细胞的迁移和侵袭,抑制细胞凋亡并加快细胞周期进程。5.Fox O3a高表达可以抑制肿瘤的生长;EPS8高表达促进肿瘤生长。6.转录因子Fox O3a通过直接结合EPS8核心启动子区中的5’-CAGTTTAC-3’序列而发挥对EPS8基因的负性调控。