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多花黑麦草(Lolium multiforum)是一年或越年生草本,在我国适生于长江流域以南地区,在江西,湖南,江苏、浙江等省区均有人工栽培,作为主要牧草。近年在中国河南、江苏及山东等区域逐渐蔓延到小麦田,成为小麦田一种恶性、抗性杂草。精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)属于乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂中的一类除草剂,是作用位点比较单一的一类除草剂,该类药剂一直是防除小麦田包括多花黑麦草在内多种禾本科杂草的重要药剂。但是,随着该类药剂的长期高频率的使用,抗药性问题也越来越严重。农业生态系统的除草剂处理对杂草施加强烈的选择压力,导致杂草对这些除草剂的抗性的演变。多花黑麦草群体对精噁唑禾草灵的抗药性在我国小麦田的发生日益普遍,造成了经济损失和有效的管理手段的丧失。为了深入了解我国河南、江苏、陕西、山东等小麦田多花黑麦草对精噁唑禾草灵抗药性的水平及进展,我们调查了 50个多花黑麦草种群对精噁唑禾草灵的抗药性水平,分析其中具有代表性的13个种群的遗传多样性和遗传结构。明确了不同多花黑麦草种群对精噁唑禾草灵的抗药性水平,且分析了不同多花黑麦草种群的遗传多样性及遗传结构和基因流的传播。对抗性种群的靶标酶基因序列分析发现了靶标位点的突变,靶标酶活性的降低,且对靶标位点的突变建立了快速检测方法。最后对不同抗性水平和机理的多花黑麦草种群做出合理的化学防除方案。本研究的主要结果如下:采用整株生物测定的方法对50个多花黑麦草种群对精噁唑禾草灵的敏感性进行测定。结果表明:抗性水平最高的为河南驻马店HZYC-6种群,其ED50值为2218.41 g a.i.·ha-1,相对与敏感对照种群JNXW-2,抗性倍数为99.39。而江苏省的四个种群JLGY-2、JLGY-6、JLGY-7、JLGY-14 及河南省的五个种群 HZGX-1、HZGX-2、HZGX-3、HZYC-4、HZYC-5也对精噁唑禾草灵产生了不同程度的较高水平的抗性(RI>20),相对抗性倍数分别为:27.92、27.96、27.47、24.57、40.13、24.06、54.59、24.36、27.40;相对敏感的种群为:JNXW-1,JNXW-2,JHHY-2,JCJT-1,JYGY-1,JLGY-8,JLGY-9,JCWJ-4等八个种群;其他地区的种群对精噁唑禾草灵产生了不同程度的相对低水平的抗性。总计50个种群中有42个种群对精噁唑禾草灵产生了抗药性,表明所研究地区的多花黑麦草对精噁唑禾草灵的抗药性已经发生较为普遍。采用染色体计数法和流式细胞术法对多花黑麦草50个种群材料进行倍性分析,结果表明只有4个种群是四倍体材料(JNXW-1,JYGY-1,JCWJ-1,JCWJ-2),其他种群材料均为二倍体材料,四倍出现的频率为8%。且四倍体材料多为敏感材料,对精噁唑禾草灵还未产生抗性。二倍体和四倍体材料进行适应性比较研究得出,四倍体大部分情况和二倍体适应能力相同,但是在极端条件,如低温,高盐,水势低等情况下,四倍体多花黑麦草显著比二倍体多花黑麦草适应能力强,更加抗寒,抗旱,耐盐。使用微卫星标记对中性遗传变异进行分析表明,无论抗性水平如何,所有种群的遗传多样性都非常高。遗传变异主要分布在种群内的个体之间,而不是在种群或样本县之间。贝叶斯聚类分析提供了两个遗传聚类或基因库之间广泛混合的群体构建的证据。高度遗传多样性和混合,以及种群之间的低分化,强烈表明通过基因流动传播抗性的潜力,以及限制种子和花粉分散在多花黑麦草中的管理需要。对不同抗性水平的种群克隆靶标序列基因分析研究后,在河南驻马店抗性种群中发现四种靶标位点的突变:Ile-1781-Leu,Ile-2041-Asn,Asp-2078-Gly,Cys-2088-Arg。这四种靶标酶突变在抗性多花黑麦草中出现的组合和频率分别是:HZGX-2种群含Ile-1781-Leu(13%),Ile-2041-Asn(7%),Asp-2078-Gly(7%);HZYC-4 种群含Ile-1781-Leu(93%),Ile-2041-Asn(7%);HZYC-5 种群含 Ile-1781-Leu(72%),Ile-2041-Asn(6%),Cys-2088-Arg(12%);HZYC-6 种群含 Ile-1781-Leu(88%),Asp-2078-Gly(42%)。靶标突变是河南驻马店抗性种群对精噁唑禾草灵产生抗性的重要机理。针对在抗性种群中发现的ACCase氨基酸抗性D2078G,C2088R,I1781L和12041N 突变建立了衍生酶切扩增多态性(dCAPS,derived cleaved amplified polymorphic sequence)的分子检测方法,该技术能够对这些突变进行快速、准确的检测。利用所建立的CAPS及dCAPS技术,对抗精噁唑禾草灵多花黑麦草HZGX-1,HZGX-2,HZYC-4,HZYC-5和HZYC-6种群中的抗性突变进行了检测。在检测的100株抗精噁唑禾草灵多花黑麦草种群HZGX-1杂草中,有80株为发生Ile-1781-Leu突变,6株发生Asp-2078-Gly突变。抗性HZYC-6种群所检测结果中88株多花黑麦草靶标出现了的I1781L突变,42株多花黑麦草检测到2078位突变(D2078G)。抗性HZGX-2种群所检测的多花黑麦草中也有13株出现了的1781位突变(11781L),7株含有2078位突变(D2078G),还发现了 7株含有2041位异亮氨酸均突变为天冬酰胺(12041N)。抗性HZYC-4种群有93株发现有I1781L突变,密码子ATA突变为CTA导致;7株含有2041位异亮氨酸均突变为天冬酰胺(12041N)。HZYC-5种群100个样本中有72株多花黑麦草有I1781L突变,16株有2041位异亮氨酸均突变为天冬酰胺(I2041N);还有12株多花黑麦草含有C2088R突变,这些结果和基因序列测序结果相一致。江苏省抗性种群JLGY-6酶活性研究发现其敏感性降低是敏感种群的9.58倍。精噁唑禾草灵抑制抗性种群酶活性50%的药剂浓度,即IC50值为24.33±4.30μM,而敏感种群的IC50值为2.47±0.61 μM,相对抗性倍数为9.85。抗性种群和野生型多花黑麦草ACCase在精噁唑禾草灵处理下所表现出来的不同的活性比表明:ACCase对精噁唑禾草灵敏感性的改变是JLGY-6种群多花黑麦草对精噁唑禾草灵产生抗药性的重要机理之一。在分析江苏省多花黑麦草的抗性种群的靶标序列中,并没有发现靶标位点的变化,在敏感和抗性靶标基因表达量的研究中,抗性和敏感种群的表达量也没有显著性的差异。并且江苏省抗性种群对除了精恶唑禾草灵外的其他类药剂如其他ACCase类抑制剂精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、炔草酯、烯草酮、烯禾啶和唑啉草酯这些药剂敏感;对ALS类、光合抑制剂类等除草剂都没有产生抗性。这说明江苏省多花黑麦草抗性种群JLGY-6对精噁唑禾草灵产生抗药性的主要原因是靶标酶活性的降低引起的。江苏省多花黑麦草种群JLGY-6种群只对精噁唑禾草灵产生了抗药性,对其他药剂仍然敏感,还较好防除,但是以河南驻马店地区为代表的抗药性种群抗性程度很高,且对其他相同作用机理的除草剂也都产生了不同程度的交互抗性。本研究主要采用河南省驻马店抗性种群来研究抗性多花黑麦草的防除问题。首先,我们发现抗性多花黑麦草种群HZYC-6对AOPP类除草剂高效氟吡甲禾灵和精喹禾灵产生了高抗性,其相对抗性倍数分别为13.85和25.96倍;该种群对炔草酯、烯禾啶这些药剂产生了中等抗性,其相对抗性倍数分别为8.84和8.77倍;对烯草酮和唑啉草酯产生了低抗,抗性倍数分别为3.25和3.65倍。这表明抗精噁唑禾草灵的HZYC-6高抗种群已经对ACCase类抑制剂都产生了不同程度的抗性,这种ACCase抑制剂类的除草剂已经不适合用于防除多花黑麦草。HZYC-6种群对ALS抑制剂甲基二磺隆、啶磺草胺、氟唑磺隆、咪唑乙烟酸和甲咪唑烟酸的的ED50值分别为8.06 g a.i.ha-1、1.66 g a.i.ha-1、5.81 g a.i.ha-1、3.71 g a.i.ha-1和2.67 g a.i.ha-1,且其ED90均小于各自药剂的田间推荐剂量,因此这几种除草剂对于防除多花黑麦草仍有很好的效果。对有机磷类除草剂草甘膦异丙胺盐、取代脲类绿麦隆、胺唑草酮和氟噻草胺的ED50值分别597.26 g a.i.ha-1、282.94 g a.i.ha-1、21.77 g a.i.ha-1 与 41.15 g a.i.ha-1,相对抗性倍数为 1.82、1.55、1.26 与 0.91倍,且ED90均小于各自药剂的田间推荐剂量,对于防除多花黑麦草还是有比较好的效果。另外,我们采用本实验室筛选出的防除抗药性菵草较好的两个复配剂在室内对抗药性多花黑麦草毒力进行了初筛,氟噻草胺·吡氟酰草胺复配剂(1:2),氟噻草胺·丙草胺复配剂(1:1.7)对小麦田多花黑麦草鲜重防除效果较好,在剂量设置范围内,对多花黑麦草防效均在90%以上且对小麦安全,对于防除抗性多花黑麦草提供了很好的药剂配方的选择。