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雌激素相关受体(Estrogen-relatedreceptor,ERR)是一种真核转录因子,参与生物体生长、生殖和新陈代谢等多种生理过程。我们实验室之前的研究显示罗氏沼虾ERR在卵巢中表达水平最高,其表达量显著高于精巢,暗示其可能在雌性罗氏沼虾生殖过程中发挥作用。为了探究ERR在罗氏沼虾生殖过程中的作用以及作用机制,检测了ERR在不同发育时期卵巢中的表达,通过注射体外转录合成的ERR双链RNA(ERRDouble-strandedRNA,ERR-dsRNA)干扰了罗氏沼虾ERR的表达,对ERR-dsRNA干扰组和对照组卵巢进行了比较转录组测序,筛选了生殖相关的差异表达基因并进行了验证,检测了其中一些基因在卵巢发育过程中的表达变化。此外,为了从蛋白水平检测ERR-dsRNA的干扰效果,利用原核表达体系诱导表达了ERR蛋白并制备了ERR抗体。主要结果如下: 1、罗氏沼虾ERR蛋白的原核表达及ERR抗体的特异性检测 成功构建了ERR蛋白原核表达质粒pET-32a-on-ERR并诱导表达出了ERR蛋白。优化得到了诱导ERR蛋白表达的最优条件:0.1mM/LIPTG、35℃、8h。纯化出了较纯的ERR蛋白并制备获得了特异性较强的ERR抗体。 2、ERR在罗氏沼虾不同发育时期卵巢中的表达 ERR在卵巢发育早期(0期和I期)表达量较高,最高表达量出现在卵巢发育I期,在卵巢发育II期和III期表达量降低,表明ERR参与了罗氏沼虾卵巢发育调控。 3、转录组测序分析筛选ERR调控的生殖相关基因 注射ERR-dsRNA后,卵巢中ERRmRNA和ERR蛋白的表达显著下降。ERR-dsRNA干扰组和对照组卵巢转录组测序获得5407条差异表达Unigene,其中上调Unigene为2490条,下调Unigene为2557条。这些差异表达Unigene有9条被富集到生殖GO条目,有3条被富集到生殖过程GO条目,有21条被富集到卵母细胞减数分裂Pathway条目。这些生殖相关的差异表达Unigene中,差异倍数较大、注释明确且与生殖密切相关的Unigene有4条,qPCR验证显示它们的表达在ERR被干扰后显著增加,与转录组测序结果一致。在这4条Unigene中,有2条Unigene在卵巢发育过程中的表达具有显著性差异,其中1条(Unigene4600_All)与卵母细胞减数分裂有关,1条(CL4888.Contig2_All)与生殖相关激素的合成以及释放有关,这些结果表明ERR可能通过调控卵母细胞减数分裂和生殖相关激素的合成与释放影响罗氏沼虾卵巢发育。 4、RNA干扰ERR的表达对罗氏沼虾卵巢生殖相关基因表达的影响 RNA干扰罗氏沼虾ERR的表达后,卵巢中生殖相关基因卵黄蛋白原基因(VTG)、组织蛋白酶基因(CathepsinL)、细胞周期蛋白基因(CyclinB)和蜕皮激素受体基因(EcR)的表达显著增加,表明ERR可以通过调控VTG和EcR(调控卵黄蛋白生成)以及CyclinB(参与卵母细胞减数分裂)的表达,进而影响卵巢发育。 以上研究结果表明,ERR可通过调控卵母细胞减数分裂、生殖相关激素的合成与释放以及卵黄生成影响罗氏沼虾卵巢的发育。