在许多心血管疾病发生时,由于心肌负荷过重、缺血、缺氧和炎症等原因常常会引起心肌纤维化的形成。心肌纤维化会降低心室壁的顺应性使心肌僵硬度增加而引起心室舒张功能障碍.心肌组织电兴奋的离散度增加而易引起室性心律失常的发生;并可影响影响心肌细胞对氧和营养物质的摄取和心肌细胞能量的产生,是难治性心衰的组织病理基础,已成为目前医学研究的热点。心肌纤维化的成因主要是心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的活化、增殖及其所分泌的胶原增生与沉积, CFs的增殖特性和功能改变是心肌纤维化的决定因素。他汀类药物系HMG-CoA还原酶抑制剂,是治疗血脂异常的有效药物,除此之外,近期临床实验证实他汀类药物可减轻左室质量;洛伐他汀可抑制血管紧张素II(angiotensin II,AII)诱导的体外培养新生大鼠心肌细胞的肥大;阿托伐他汀可抑制CFs的增殖和胶原合成。血脂康为调节异常血脂的中药,是由特制红曲在特殊的工艺条件下发酵精制而成,化学组成比较复杂,有多种有效成分:除明显的降脂疗效外,有研究显示血脂康可改善高血压患者的心室舒张功能,与安慰剂组比较,左心室肥厚的发展程度延缓,提示血脂康可延缓压力负荷性左心室重塑,为更好地临床应用血脂康提供了新的视角。本研究以体外原代培养CFs为模型,进一步研究血脂康对心肌纤维化的影响,探讨了血脂康抑制CFs增殖和胶原合成的效果及其信号通路调节机制,为预防和逆转心肌纤维化提供实验和理论依据,并观察了其对原发性高血压病患者左室舒张功能和心率变异性的影响,为更好使用血脂康提供理论依据。第一部分:心肌纤维化细胞培养模型的建立目的:CFs是心肌纤维化的主要效应细胞,在心肌细胞外基质(ECM)的形成中起重要作用。其增殖特性和功能的改变是心肌结构改变的决定因素。AngII具有生长因子的作用,有上调细胞因子、促进细胞增生和调节细胞外基质代谢等作用,本实验中,我们建立了新生大鼠CFs的原代细胞培养,观察了AngII处理对心肌成纤维细胞增殖的影响,建立了心肌纤维化的细胞培养模型,为开展药物对CFs增殖影响的实验提供可靠保证。方法:心肌成纤维细胞原代培养采用胰蛋白酶消化及差速贴壁法。培养至细胞层融合后,用0.25 %胰蛋白酶消化传代,第2~3代细胞用于实验。通过细胞形态观察和免疫组织化学染色鉴定心肌成纤维细胞纯度;台盼蓝染色检测细胞活性;噻唑蓝比色法(MTT法)检测心肌成纤维细胞增殖;采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。结果:显微镜下观察可见原代培养的CFS呈不规则三角形,胞质淡而几乎透明,折光弱,细胞核较大,呈椭圆形,通常含2～3个核,无自发性搏动。台盼蓝染色活细胞数大于97%。免疫细胞化学染色纤维连接蛋白染色呈阳性,波形蛋白染色呈阳性,血管平滑肌肌动蛋白染色呈阴性,PBS对照呈阴性,符合成纤维细胞的染色特征,鉴定为所需的CFS,纯度达98%。MTT法测定AngII对心肌成纤维细胞增殖的影响,结果可见,浓度为10-8mol/L, 10-7mol/L,10-6mol/L和10-5mol/L的AngII促进了心肌成纤维细胞的增生,此作用呈浓度依赖性,与正常对照组比较p <0.05,其中以10-6mol/L时OD值最大,差异十分显著,以AngII浓度为10-6mol/L作用于CFs 24 h,48 h,72h, CFs增殖呈时间依赖性,选取48h为AngII作用时间以确保药物作用充分。结论:上述结果显示,通过胰酶消化、差速贴壁法可获高纯度的新生大鼠原代培养CFs;AngII在浓度为10-6mol/L时可促进心肌成纤维细胞增殖,选取48h为AngII作用时间。此系统可作为心肌纤维化研究的细胞培养模型,用于药物对CFs增殖影响的实验研究。第二部分:血脂康对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响目的:他汀类药物可抑制Ang II诱导的大鼠心肌细胞的肥大,且对醛固酮诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖有拮抗作用。血脂康中含有的Monacolins,该药是否也具抑制心肌纤维化的作用尚未见报道,本实验观察了血脂康对心肌成纤维细胞增殖及TGF-β1表达的影响,以期从细胞水平上探索血脂康是否具有预防和逆转心肌纤维化的作用;并探讨其可能机制。方法:实验采用上述心肌纤维化细胞培养模型,将第二代心脏成纤维细胞调整浓度为5×104细胞/ml,接种于培养板。待细胞生长至80 %融合时,吸去原培养液,PBS洗涤2次,按分组不同分别加入不同剌激因素:⑴对照组:含10 %胎牛血清的DMEM;⑵AngII组:AngⅡ10-6mol.L-1+含10 %胎牛血清的DMEM;⑶AngII 10-6mol.L-1+血脂康30ug.ml-1+含10 %胎牛血清的DMEM;⑷AngII 10-6mol.L-1 +血脂康150 ug.ml-1+含10 %胎牛血清的DMEM;⑸AngII 10-6mol.L-1 +血脂康750 ug.ml-1+含10 %胎牛血清的DMEM.培养48 h后,用0.25 %胰蛋白酶消化至细胞分离,收集各孔细胞,台盼蓝染色血细胞计数板上进行活细胞计数或MTT法检测CFs增殖情况:细胞周期分析也于处理48 h后进行,采用碘化丙啶(PI)染色,在流式细胞仪检测, Modfit软件分析细胞周期;血脂康对CFs分泌TGF-β1蛋白的影响采用ELISA法测定,按试剂盒说明方法进行,用酶联免疫检测仪测450 nm波长A值。根据标准曲线,计算TGF-β1浓度;化学比色法测定血脂康对CFs LDH活性的影响,按试剂盒说明方法进行。结果:用细胞计数法测定血脂康对AngⅡ诱导的CFs增殖的影响,结果可见: AngⅡ在浓度为10-6mol刺激CFs增殖,不同浓度的血脂康组细胞数均有不同程度的下降,并随浓度增加细胞数下降更明显,呈剂量依赖性,与AngⅡ组相比,差异有显著性(P<0.01);表明血脂康对AngⅡ剌激的心肌成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用;用MTT比色法测定血脂康对CFs增殖的影响,所获结果与细胞计数法基本一致。流式细胞仪测定血脂康对CFs细胞周期的影响:发现加入AngⅡ后,心肌成纤维细胞G0/G1期细胞百分比下降,S期、G2/M期细胞百分比升高;血脂康组G0/G1期细胞百分比显著高于AngⅡ组,而S期、G2/M期细胞百分比明显低于AngⅡ组,且呈剂量依赖关系;表明血脂康具有阻止AngⅡ的剌激细胞进入增殖周期的作用。用ELISA法测定细胞培养上清的TGF-β1含量,与无血清DMEM对照组相比, AngⅡ(10-6mol.L-1)能明显增加心肌成纤维细胞培养液中的TGF-β1含量,血脂康能阻断AngⅡ的这种作用(P<0.01)。化学比色法测定了细胞培养上清液LDH活性,血脂康在30~750 ug.ml-1对细胞作用72h,LDH活性无显著性差异。结论:本研究显示血脂康具有抑制Ang II诱导的CFs增殖的作用,这种作用不是血脂康本身的细胞毒性所致,有可能是通过抑制AngⅡ剌激的细胞TGF-β1的表达和/或阻止AngⅡ剌激的细胞进入增殖周期的作用实现的。第三部分:血脂康对AII诱导新生大鼠心肌成纤维细胞胶原合成及其机制的初步研究:目的:心肌纤维化包括成纤维细胞表型的转变,心肌胶原纤维成分不成比例地增多,排列紊乱,心肌间质胶原合成和降解比例失调等多个方面的改变。有报道表明AngⅡ除促进CFS的增殖外也促进CFS胶原的合成。本研究的第二部分已观察到血脂康可抑制CFS增殖,但血脂康干预后对I型胶原、III型胶原产生影响,以及其对细胞早期反应基因蛋白c-fos和转化生长因子TGF-β1表达的影响,尚未见报道,本部分观察了这些指标的变化。方法:CFs的培养和鉴定同第一部分;细胞培养和实验分组同第二部分,用天狼星红法分别测定各实验组培养上清中胶原蛋白含量。细胞总RNA提取采用Trizol法,RT-PCR法检测I、III型胶原、C-fos和TGF-β1 mRNA的表达,GAPDH用于作内参照。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后紫外透射反射仪观察扩增产物的大小及亮度并摄影。使用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析,以GAPDH为内参照,以各条带与GAPDH条带的密度比值代表相应基因mRNA的相对表达量。结果在细胞经处理后48小时后,10-6mol的AngⅡ使CFs胶原蛋白的产生增加,不同浓度的血脂康组胶原蛋白产量均有不同程度的下降,并随浓度增加下降更明显,呈剂量依赖性,与AngⅡ组相比,差异有显著性(P<0.01)。表明血脂康对AngⅡ剌激的心肌成纤维细胞胶原产生具有明显的抑制作用。RT-PCR扩增结果可见,与对照组相比, AngⅡ(10-6mol/L)能明显增加CFs c-fos、TGF-β1、I型胶原和III型胶原mRNA表达,血脂康浓度>30μg/ml时能减弱AngⅡ的这种作用,浓度大于150μg/ml时作用有显著意义。结论:此结果表明,血脂康从转录和翻译水平抑制了AngⅡ诱导的CFs I型胶原、III型胶原和TGF-β1的表达;在基因调控水平上血脂康抑制了c-fos的表达,这可能是其抑制AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原合成作用的分子机制。第四部分:血脂康对原发性高血压病患者左室舒张功能和心率变异性的影响目的:高血压病是目前国内发病率最高的心血管疾病,高血压性心脏损害的主要病理改变包括心肌胶原容积分数增高和心肌细胞肥大为基础的左室重构和心肌纤维化,使心肌僵硬度增加,影响了心室舒张功能。通过对心脏构型及舒张功能的观察,能够反映高血压病患者心室重构的程度。前面几部分研究结果显示血脂康可改善心肌纤维化,本研究从整体水平观测了原发性高血压病患者二尖瓣口血流多普勒频谱、二尖瓣环舒张期速度比Em/Am及E/Em探讨高血压病患者左室整体舒张功能与心室局部舒张功能的变化及血脂康治疗后高血压病人左心室舒张功能的变化,结合24小时动态心电图测定的心率变异时域指标研究血脂康的干预效应。方法:高血压病患者51例,随机分为两组,血脂康组26例,常规治疗组25例;对照组20例。于血脂康治疗72周前后采用组织速度成像了解病人左心室舒张功能的变化、做24小时动态心电图测定心率变异的时域指标。结果:高血压病组与健康对照组比较,HRV指标SDNN、RMSSD显著降低;TDI指标中E/Em显著降低, P<0.05;常规治疗组与血脂康组比较, HRV指标中SDNN、RMSSD、PNN50明显升高,P<0.05;TDI指标中Em/Am显著升高,E/Em显著降低P<0.01;HRV指标SDNN与TDI指标E/Em有相关性, r=0.61。结论:上述结果表明血脂康能明显改善高血压病患者心脏舒张功能,提高心率变异性。结合前面血脂康的基础研究,提示血脂康改善心室功能的原因之一可能是胶原合成状态的改善及心肌成纤维细胞增殖的抑制。