脾脏是一个专门摄取血源性抗原引起免疫反应的外周淋巴器官。脾脏白髓和红髓的结构分区使其能够有效地清除循环中的衰老红细胞以及抗原物质。作为体内最大的淋巴器官,脾脏内含丰富的免疫活性细胞T、B淋巴细胞,能够直接介导细胞免疫和体液免疫应答,共同调节机体在抗细菌和抗病毒感染中起防御作用。禽类脾脏结构与免疫细胞的组成具有一定的特殊性,有别于哺乳类,但与爬行类脾脏结构相似,主要表现为:禽类脾脏缺乏边缘区;白髓中动脉周围淋巴鞘(PALS)面积减少,增加了椭球周围淋巴鞘(PELS ),并且PALS主要分布T淋巴细胞,而PELS主要为B淋巴细胞分布区域。虽然哺乳动物脾脏的免疫形态与功能研究已有阐述,但关于禽类脾脏详细的免疫功能分区及其免疫学意义尚待揭示。目前为止,关于血-脾屏障的报道仅限于哺乳类和爬行类。血-脾屏障是免疫屏障的新概念,脾脏免疫功能的维持与血-脾屏障结构的完善密切相关。由于禽类缺乏边缘区结构,禽类脾脏是否具有血-脾屏障结构且血-脾屏障的细胞组成如何?爬行类脾脏中有关于高内皮毛细血管的报道,而高内皮是淋巴细胞归巢发生的结构基础。与哺乳类不同,禽类脾脏组织是否具有高内皮毛细血管并发生淋巴细胞归巢,其机理如何?针对上述问题,本文首先对鸡血-脾屏障结构进行研究,确立了血-脾屏障在鸡脾脏中的分布位置、细胞组成以及免疫屏障功能,并对不同日龄鸡脾脏中的屏障结构的胚后发育进一步观察,通过对鞘毛细血管内皮细胞的研究发现脾脏中淋巴细胞归巢的发生,进而从不同角度揭示鸡血-脾屏障及其高内皮的立体构筑和细胞学特性;进一步在分子水平阐述鸡脾脏中淋巴细胞归巢的分子基础和内在机制。研究结果将从细胞和分子水平上阐明鸡脾脏的免疫机制以及免疫学特性,丰富比较免疫学内容,为禽类传染性疾病的发病机制和治疗提供科学依据。试验Ⅰ鸡血-脾屏障的发现与结构组成应用光镜和透射电镜技术,结合翼静脉注射碳粒悬液和细胞化学方法确立鸡血-脾屏障的位置及屏障细胞组成。结果显示,鸡脾脏白髓包括动脉周围淋巴鞘(PALS)、椭球周围淋巴鞘(PELS)和脾小体,缺乏边缘区。鞘毛细血管末端直接与脾窦相连,鸡脾脏循环模式为闭合式循环。注射印度墨汁30min、1h、6h、12h、24h、2d、3d、5d、7d,发现PELS内椭球周围有明显的碳粒分布,而红髓和脾小体没有碳粒出现。2d内碳粒集中分布于椭球周围。随着时间的迁移,到达7d碳粒逐渐扩散至PELS、PALS和脾小体,提示鸡血-脾屏障在对抗外源碳粒的初期主要起到机械屏障作用,能够将碳粒抵挡在椭球结构和PELS,随着时间的迁移,脾脏的生物屏障发挥重要作用。碳粒被逐渐吞噬并且迁移至PALS和脾小体,为脾脏发挥特异性免疫起到重要的信息传递。细胞化学染色显示,网状纤维在椭球结构呈同心圆状分布,构成血-脾屏障的支架。酸性磷酸酶(ACP )在椭球相关细胞(EAC )、网状细胞和巨噬细胞呈阳性反应。主要组织相容性复合体MLCH在EAC上为免疫组化阳性反应。综上可见,鸡血-脾屏障位于脾脏椭球和PELS,血-脾屏障是动、静脉之间的网状组织结构,主要由血管内皮细胞、支持细胞、椭球相关细胞、网状纤维、网状细胞和巨噬细胞等构成。试验Ⅱ不同日龄鸡血-脾屏障的胚后发育研究脾脏是鸡体内最大的外周淋巴器官,是免疫活性细胞增殖、定居以及对抗原刺激发生免疫应答的重要场所。本实验通过对出壳后不同日龄鸡翼静脉注射墨汁,观察血-脾屏障在出壳后1、7、14、21、35和60日龄的碳粒阻滞位置;通过CD3和Bu-1标记T、B淋巴细胞,MHCⅡ标记抗原递呈细胞,研究其在不同日龄鸡脾脏的分布变化;从基因水平上研究免疫相关基因TLRs ( TLR2和TLR4 )和细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)在不同日龄鸡脾脏的表达变化。结果显示,出壳后1日龄鸡血-脾屏障初步形成,但红髓仍可见未被阻挡的碳粒。随着日龄增加,14日龄至成年,屏障作用逐渐完善,碳粒被血-脾屏障阻挡在椭球和PELS区域。CD3+ T淋巴细胞主要分布于PALS和红髓,随着日龄的增长,PALS和红髓T淋巴细胞数量逐渐增加。Bu-1+B淋巴细胞分布于PELS和脾小体,随着日龄的增长,PELS的B淋巴细胞数量逐渐增加。MHCⅠI+细胞主要分布于脾脏椭球周围和红髓,并且自出壳后1日龄至成年增长趋势不显著。基因水平上,1日龄至60日龄鸡脾脏TLR2、TLR4、IL-2、IFN-y和TNF-αmRNA在出壳初期表达较高,两周后随日龄增长逐渐降低趋于稳定。由以上结果可见,鸡血-脾屏障结构随着日龄的增长逐渐发育完善。试验Ⅲ鸡脾脏椭球高内皮的细微结构及归巢地址素的表达鸡脾脏结构有着不同于哺乳类脾脏的特殊性,其椭球鞘毛细血管有着禽类特有的高内皮细胞。本文应用光镜和电镜技术观察鸡脾脏椭球结构内鞘毛细血管的内皮结构特征,通过免疫组织化学方法探究淋巴细胞归巢相关的血管细胞粘附分子VCAM-1和黏膜血管粘附分子MADCAM-1在鸡脾脏鞘毛细血管上的表达分布。结果表明,鸡脾脏内的鞘毛细血管内皮细胞呈立方状,电镜下可见淋巴细胞出现在椭球中,位于内皮细胞和血管通道附近。其中,鞘毛细血管的基底膜不连续,并有血管通道延伸至椭球内部,淋巴细胞位于延伸的血管通道处。VCAM-1和MADCAM-1在鞘毛细血管上为阳性,进一步证实了鞘毛细血管内皮细胞是鸡脾脏淋巴细胞归巢发生的场所,为深入研究鸡脾脏淋巴细胞归巢的分子机制提供依据。试验Ⅳ脾脏淋巴细胞归巢的比较研究在脾脏的进化过程中,禽类与爬行类脾脏结构类似,缺乏边缘区,脾脏白髓由动脉周围淋巴鞘(PALS )和椭球周围淋巴鞘(PELS )组成,唯一不同的是生发中心在禽类中开始形成,而爬行类脾脏没有生发中心的出现。中华鳖属于爬行纲龟鳖目,由于中华鳖脾脏的椭球内血管为高内皮血管与鸡脾脏高内皮相似,相当于哺乳类淋巴结的高内皮后微静脉,也是研究脾脏中淋巴细胞归巢的重要模型。本实验应用光镜和透射电镜技术观察中华鳖与鸡脾脏的形态结构特征。结果表明,中华鳖脾脏的鞘毛细血管与鸡脾脏类似,血管内皮为立方状,类似于高内皮后微静脉血管。脾脏椭球结构有淋巴细胞出现,并且椭球毛细血管含有促进淋巴细胞从血液迁移到脾脏白髓的血管微通道。淋巴细胞通过鞘毛细血管微通道迁移到脾脏白髓的过程包括(1 )淋巴细胞通过血管内皮细胞形成的血管微通道,穿过鞘毛细血管基底膜;(2)在支持细胞和椭球相关细胞(EAC)及其细胞突起的相互作用下,淋巴细胞迁移进入椭球结构;(3)淋巴细胞在椭球结构通过血管微通道迁移至PELS。研究结果描绘了淋巴细胞在脾脏由血液迁移至脾脏椭球的形态学证据,同时为禽类和爬行类动物脾脏淋巴细胞归巢的机制研究提供了细胞学基础。试验V LPS炎症刺激下鸡脾脏淋巴细胞归巢的机制研究(Ⅰ)整合素连接激酶的原核表达与多抗制备整合素连接激酶(ILK)是一种苏氨酸/丝氨酸的蛋白激酶,是整合素胞外区与胞内区信号传导以及细胞信号通路的重要枢纽。为获得鸡ILK多克隆抗体,用以研究整合素相关归巢因子在鸡脾脏的信号通路。本实验以ILK编码区基因序列为模板,加入酶切位点设计引物,扩增ILK抗原区域,将产物经限制性内切酶KpnI和XhoI的作用后与原核表达载体pET-30(a)+连接,构建pET-30(a)+-ILK重组质粒。通过优化表达条件,使目的蛋白在BL21 (DE3)中表达。结果显示,重组蛋白以包涵体形式存在,分子量约为27kD。重组蛋白通过Ni2+亲和层析柱纯化后加佐剂免疫兔子制备多抗,四免后采血分离血清即为抗血清,再对抗血清进行IgG分离纯化。通过间接Elisa测得抗血清效价为1:32000以上,Western blot检测抗体特异性较好,能够用于下一节鸡脾脏淋巴细胞归巢的蛋白实验。(Ⅱ) LPS炎症刺激下鸡脾脏淋巴细胞归巢的机制研究本实验通过腹腔注射脂多糖(LPS)制造炎症模型,体外荧光标记淋巴细胞示踪淋巴细胞在鸡脾脏不同时间的归巢动态。免疫组化研究脾脏T、B淋巴细胞在LPS处理下的归巢分布变化。荧光定量PCR和蛋白免疫印迹Western blot研究鸡脾脏归巢相关粘附分子在LPS处理下的基因蛋白表达变化。结果显示,CFSE标记的淋巴细胞通过鞘毛细血管首先归巢至鸡脾脏白髓椭球,随着时间推移,逐渐迁移至红髓区域。CD3、Bu-1免疫组化显示LPS处理下,白髓椭球周围淋巴鞘(PELS) B淋巴细胞减少,红髓B淋巴细胞增多但T淋巴细胞减少。电镜观察发现,LPS刺激下血液中的淋巴细胞跨高内皮细胞迁移至脾脏椭球结构。荧光定量PCR和免疫蛋白印迹Western blot研究显示归巢因子整合素β1及其配体血管细胞粘附分子VCAM-1在LPS刺激下基因和蛋白表达明显增加。此外,LPS的刺激上调了整合素连接激酶ILK和磷酸化AKT Ser473的基因蛋白表达。LPS影响鸡脾脏归巢因子整合素β1和血管细胞粘附分子VCAM-1的表达可能是通过整合素连接酶ILK磷酸化PKB/AKT通路的作用,从而诱导淋巴细胞在脾脏中的细胞迁移和分区变化。鸡脾脏首次研究淋巴细胞归巢将有助于补充禽类免疫学相关内容,为进一步研究淋巴细胞归巢在禽类传染性疾病的治疗方面提供重要的靶向措施。