论文部分内容阅读
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)道地性问题是丹参药材质量问题的核心内容,而解析丹参道地性遗传机制是解决丹参质量问题的根本。本研究在发现丹参乙酰乙酰辅酶A硫解酶(SmAACT)、4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(SmCMK)、忙牛儿基忙牛儿基二磷酸合酶(SmGGPPS)以及贝壳杉烯样合成酶(SmKSL)关键功能基因“产地趋向变异(GVT)”的基础上,以功能基因SmAACT作为模板,克隆不同产地功能基因的变异类型,采用原核表达的研究方法,结合基于LC-MS技术的体外物质代谢分析方法,解析丹参功能基因的GVT规律对关键酶生物合成功能的影响,从而为深入揭示丹参道地性形成的遗传机制提供了支持。具体研究成果如下:1.成功克隆的SmCMK基因全长并发现产地趋向变异现象SmCMK基因全长为1191 bp,编码397个氨基酸残基,理论分子量(Molecularweight,MW)为43.33kDa,等电点(PI)为6.67,具有一定亲水性,结构稳定。N端1-53位氨基酸残基可能为信号肽,主要定位于叶绿体,与胡黄连Picrorhiza kurrooa CMK的亲缘关系最近。同时,发现SmCMK基因的产地趋向变异位点有6个,分别位于62bp、113bp、453bp、511bp、711bp和1110bp处。在62bp和113bp处;河北居群存在产地特化变异类型,并出现了两处产地特化的“非同义突变”。2.成功克隆的SmGGPPS基因全长并发现产地趋向变异现象克隆的SmGGPPS基因全长为1095 bp,编码365个氨基酸残基,理论分子量(Molecular weight,MW)为39.98kDa,等电点(PI)为6.13,具有一定疏水性,结构稳定。N端1-10位氨基酸残基可能为信号肽,主要定位于叶绿体,该GGPPS具有聚丙烯合成酶活性,与野甘草Scoparia dulcis GGPPS的亲缘关系最近。同时,发现SmGGPPS存在“产地趋向变异”现象,共发现可分析的产地趋向变异位点 8 个,分别位于 120bp、126bp、189bp、195bp、284bp、285bp、705bp 和 894bp 处;四川居群在894bp存在产地特化变异类型。3.成功克隆的SmKSL基因全长并发现产地趋向变异现象克隆的SmKSL基因全长为1788 bp,编码595个氨基酸残基,理论分子量(Molecular weight,MW)为68.42kDa,等电点(PI)为5.79,具有一定亲水性,结构稳定。N端1-19位氨基酸残基可能为信号肽,主要定位于叶绿体,有1个保守结构域,与迷迭香属椴木Rosmarinus officinals KSL 的亲缘关系最近。同时,发现SmKSL存在产地趋向变异位点19个,分别位于243bp、379bp、411bp、459bp、468bp、543bp、666bp、706bp、763bp、765bp、1044bp、1045bp、1353bp、1488bp、1533bp、1578bp、1582bp、1596bp和1616bp处;河北、内蒙、山东、四川居群存在产地特化变异类型。并且不同产地丹参居群“产地趋向变异”的突变位点出现了较多的“非同义突变”。4.成功克隆的SmAACT基因全长并发现产地趋向变异现象克隆的SmAACT基因全长为1212 bp,编码404个氨基酸残基,理论分子量(Molecular weight,MW)为41.27kDa,等电点(PI)为6.33,具有一定疏水性,结构稳定。N端1-11位氨基酸残基可能为信号肽,主要定位于其他途径,有2个保守结构域,与新疆紫草Amebia euchroma AACT的亲缘关系最近。同时,发现SmAACT存在产地趋向变异位点9个,分别位于111bp、195bp、324bp、492bp、795bp、981bp、1116bp、1158bp和1161bp处;河北、内蒙和河南居群存在产地特化变异类型。5.成功建立原核表达体系成功建立SmAACT、SmCMK、SmGGPPS、SmKSL原核重组表达体系,确定可溶最佳诱导条件为:诱导温度18℃、诱导时间18h、IPTG为0.8 mmol·L-1、A600为1.0;确定纯化目的蛋白的条件为:先经不同梯度浓度咪唑多次洗脱后,最终经500mM浓度的咪唑洗脱。6.成功验证SmAACT的功能并深入分析不同产地基因型对催化效能的影响。证明丹参SmAACT基因具有催化2分子乙酰辅酶A产生1分子乙酰乙酰辅酶A的功能。催化效能比较显示,湖北的AACT的催化效能最高,其次是,山西、山东、四川、内蒙、河南、河北,其中河北和内蒙的AACT催化效能最低。SmAACT的催化效能与道地产区分布一致,结果印证了丹参的道地性。综上所述,SmCMK、SmGGPPS、SmKSL和SmAACT均发现了产地趋向变异现象,SmAACT的催化效能分析也进一步印证了丹参的道地性。因此,本研究能够为进一步揭示丹参道地性的遗传机制提供良好支持。