结直肠癌是常见消化系统恶性肿瘤，近年来在我国的发病率逐渐增高，早期诊治意义重大。其病因复杂，发病与抑癌基因失控或缺失、癌基因的异常激活或突变及凋亡调控机制发生紊乱等生物学改变有关。更多的研究进一步证实，传导通路的异常是结直肠癌发生发展的关键性因素。　　Caveolae（小凹）是细胞质膜上凹陷形成的烧瓶状内陷或囊泡结构，参与许多细胞生命活动，如胞吞（endocytosis）、胆固醇的运输、胞膜组装、信号传导和肿瘤生成等。Caveolin-1（小凹蛋白-1，Cav-1）是Caveolae的重要标志性蛋白，分子量为21-24kDa，参与调节肿瘤发生、发展过程中多种信号传导分子和信号通路的活性，对肿瘤细胞的增殖，凋亡，迁移，耐药等各个方面产生影响。Cav-1可通过与EGFR结合并抑制其磷酸化的方式来影响肿瘤的进程。在结直肠癌的发病中，Cav-1是否对EGFR通路产生活化，及其是否对EGFR通路下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt 等信号转导通路产生影响，都需要进一步研究。　　表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因c-erbB-1的表达产物，又称HER1，分子量为 170KD，在CRC发生和发展中具有重要的作用。70-90%左右的结直肠肿瘤中EGFR呈高表达，且EGFR的表达程度与结直肠癌分期、有无淋巴结或远处转移、血管浸润、疾病进展及死亡率高呈正相关。EGFR与配体结合后会形成异源或同源二聚体，继而引起位于胞内段的受体酪氨酸激酶发生自身的磷酸化，引起其下游MAPK/ERK、PI3K-Akt 等许多条信号转导通路发生活化或抑制，最终可导致肿瘤或其他多种疾病的发生。　　PI3K/Akt 是一条非常重要的信号通路，主要作用是调节细胞生存，参与多种恶性肿瘤的生物学活动，其被过度活化会导致细胞凋亡受抑制，促进细胞的侵袭和远处转移，导致细胞过度增殖，血管生成过度、对化疗药物耐受、对放射治疗抵抗等。　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）能被多种物质激活，属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MEK是其家族成员之一，ERK是细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase,），有ERK1/ERK2两个重要成员，磷酸化后成为其活性形式p-ERK，MEK-ERK信号转导通路被活化后，会调节细胞转录因子的活性，主要参与细胞的生长和分化过程，在许多肿瘤的侵袭和远处转移过程中起着非常重要的作用。　　为此设计本研究，首先应用蛋白印迹（Western blot，WB）的方法对人类结直肠癌细胞 T84、SW620、HCT116、SW837、HT29、SW480 进行筛选，选取EGFR高表达，Cav-1弱表达的SW480细胞进行下一步研究。然后通过质粒转染技术上调Cav-1的表达，再通过Western blot验证转染效果。利用增殖实验（MTS）、划痕修复实验（Wound healing）和侵袭实验（Transwell）研究Cav-1对人结直肠癌 SW480 细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响。经Western blot检测Cav-1表达变化对EGFR及其下游信号磷酸化水平的影响。收集临床标本，采用免疫组织化学法探讨人结直肠癌组织中 Cav-1的表达与临床特征的关系。旨在为Cav-1成为结直肠癌临床诊治参考指标和靶向治疗等提供理论依据。目前国内外均未见相关报道，实验具有创新性。本研究分以下三个部分：　　第一部分 Caveolin-1对体外培养结直肠癌细胞生物学行为的影响　　目的：研究Cav-1对人结直肠癌 SW480 细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响。　　方法：　　1. 细胞复苏和培养　　将结直肠癌细胞冻存管从液氮中取出，37℃恒温水浴箱融化，加入含有10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml的1640完全培养基中，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。　　2. Western blot方法检测细胞中Cav-1的表达情况　　通过Western blot方法分别检测所培养的6种结直肠癌细胞株中Cav-1的表达水平。　　3. 通过稳定质粒转染技术建立Cav-1基因过表达的SW480 细胞株　　将 pcDNA3.1/Cav-1 质粒和 pcDNA3.1 阴性对照质粒分别转染到EGFR高表达，Cav-1弱表达的结直肠癌SW480细胞，然后用G418筛选，得到Cav-1过表达的稳定转染细胞株（SW480/Cav-1）和阴性对照组细胞（SW480/pcDNA3.1）。　　4. MTS法体外检测 Cav-1对SW480细胞增殖能力的影响　　将SW480/Cav-1细胞及SW480/pcDNA3.1细胞接种于 96孔板，血清饥饿4小时，然后经不同浓度的EGF刺激后加入MTS，在酶标仪490 nm波长处测定OD值，检测2组稳定转染细胞株的增殖能力。　　5. 划痕法体外检测Cav-1对人结直肠癌SW480细胞迁移能力的影响　　将两组细胞消化后分别接种于24 孔板，过夜贴壁后形成单细胞层，用移液器吸头在单层细胞划痕，在有或无EGF刺激的环境中培养，在显微镜下观察划痕愈合情况，并计时拍照直至划痕愈合。　　6. 通过Transwell法体外检测Cav-1对人结直肠癌SW480细胞侵袭能力的检测　　小室的上室均匀铺基质胶，两组细胞分别接种于上层小室，上层培养液中不含胎牛血清，下层培养液含有10%胎牛血清，孵育24h后将小室取出，将穿膜细胞固定、HE染色，在显微镜下拍照计数。　　结果：　　1. Cav-1在不同结直肠癌细胞株中的表达情况　　检测6种结直肠癌细胞细胞中Cav-1和EGFR蛋白的表达，结果显示SW480细胞中Cav-1弱表达,且其EGFR表达水平最强，符合后续实验条件。　　2. 稳定转染结直肠癌细胞株中Cav-1蛋白水平检测　　SW480/Cav-1细胞中的Cav-1相对表达量明显高于SW480/pcDNA3.1细胞和SW480细胞；而SW480/pcDNA3.1细胞和SW480细胞之间，Cav-1表达无明显差异。结果证实：Cav-1过表达的稳定转染细胞株构建成功。　　3. 过表达Cav-1减弱SW480细胞株增殖能力　　MTS 法检测两组稳定转染的结直肠癌SW480细胞增殖能力，结果显示在各种浓度（0nM、4nM、20nM、100nM） EGF 刺激下，SW480/Cav-1组各浓度OD值均明显低于SW480/pcDNA3.1 细胞组。（P＜0.01）。　　4. 过表达Cav-1降低SW480细胞株的迁移能力　　无或有EGF的刺激，细胞在不同时间点的迁移率SW480/Cav-1组均明显低于SW480/pcDNA3.1组（P＜0.05）。　　5. 过表达Cav-1减弱SW480细胞株的侵袭能力　　SW480/Cav-1 组细胞穿过基质胶的侵袭能力大约是 SW480/pcDNA3.1组的56%，有统计学意义（P＜0.05）。　　第二部分 Caveolin-1对直肠癌细胞表皮生长因子受体信号通路活化的影响　　目的：检测Cav-1表达变化对EGFR及其下游信号磷酸化水平的影响。　　方法：将SW480/Cav-1及SW480/pcDNA3.1细胞分别接种、培养后，给予EGF刺激，分别于不同时间点收集细胞，提取总蛋白；采用Western blot法检测2 组细胞Cav-1、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK的蛋白表达情况，统计分析。　　结果：Cav-1过表达对结直肠癌细胞 SW480 EGFR活化的影响　　统计结果显示，Cav-1的表达量：SW480/Cav-1组在各时间点均显著高于 SW480/pcDNA3.1组（P＜0.01）；SW480/Cav-1组 p-EGFR在刺激后的表达量均明显低于SW480/pcDNA3.1组（P＜0.01）；SW480/Cav-1组 p-Akt及p-ERK在各个时间点的表达水平也均明显低于SW480/pcDNA3.1组（P＜0.01）。　　第三部分 EGFR阳性结直肠癌组织中Caveolin-1蛋白表达与临床病理特征的关系　　目的：了解人结直肠癌组织中 Cav-1的表达与临床特征的关系。　　方法：随机选取82例经手术切除确诊为结直肠癌的石蜡标本，采用免疫组化法检测其EGFR在结直肠癌组织中的表达情况。选取其中EGFR阳性表达者76例进一步分析Cav-1、和Ki-67的表达情况，方法同EGFR，研究Cav-1在结直肠癌组织中的表达及与临床病理学特征的相关性。　　结果：　　1. Cav-1、EGFR在结直肠癌组织中均为胞浆或胞膜着色，阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒状，胞核不着色。EGFR蛋白表达阳性率为92.68%(76/82)。Cav-1蛋白阳性表达率为56.58%(43/76)。　　Ki-67 蛋白在细胞核表达，阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒状，阳性表达率为 52.63%(40/76)。　　2. Cav-1和Ki-67与结直肠癌临床病理特征的关系　　在76例结直肠癌组织中，Cav-1蛋白的表达与性别、年龄及分化程度等无关；与有无淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关，其差异均有显著性（P＜0.05）；Ki-67的表达与肿瘤分期有关，Ⅲ、Ⅳ期肿瘤表达率高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）。　　3. Cav-1与Ki-67在EGFR阳性结直肠癌组织中表达的相关性Cav-1和 Ki-67二者表达呈负相关（r=-0.283，P=0.024）。　　结论：　　1. 体外实验表明Cav-1过表达可抑制结直肠癌细胞SW480的增殖、迁移和侵袭能力；　　2. Cav-1通过抑制结直肠癌细胞EGFR的磷酸化，进而影响ERK、Akt的磷酸化，最终抑制结直肠癌细胞的生长。　　3. Cav-1表达程度与人结直肠癌组织TNM分期及淋巴结和远处转移有关，Cav-1在大肠癌组织表达与 Ki-67 呈负相关，抑制肿瘤生长。