苯暴露可引起造血系统恶性肿瘤,苯造血毒性的分子机制迄今尚未完全阐明。研究苯暴露早期阶段到苯造血毒性发生发展过程中的关键事件及相关分子机制可以为苯中毒的诊断干预及早期预防提供科学依据。系统生物学研究显示,机体细胞在生理病理不同状态及疾病发生发展不同阶段都具有特异性的代谢特征。本研究拟通过建立苯中毒小鼠模型,获得小鼠外周循环及造血细胞的代谢特征,结合毒理学实验和生物信息学结果分析特征性改变内源性小分子物质的相关代谢通路;进一步研究苯造血毒性相关的特异性代谢通路变化及作用机制;在此基础上探讨乙酰左旋肉碱干预是否影响苯暴露所致造血毒性、线粒体功能障碍和氧化应激;最后初步探讨了苯暴露对癌基因MDS-Evi1表达的影响以及该基因在造血干细胞凋亡调控中的作用机制。第一章苯中毒小鼠模型的建立及造血抑制毒性研究使用C3H/He小鼠,苯暴露剂量为0、150及300 mg/kg·bw,皮下注射方式染毒,每天1次,连续5天,共染毒4周,构建苯中毒小鼠模型,模型构建后进行小鼠外周血常规、骨组织病理学、骨髓涂片、造血干细胞比例及造血集落形成能力检查。结果显示,通过皮下注射的染毒方式可成功构建苯中毒小鼠模型,苯暴露对小鼠神经系统初期为兴奋效应,后期为抑制作用;苯暴露降低小鼠外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板计数,引起贫血,组织病理学检查结果显示苯引起小鼠骨髓和脾脏造血抑制,骨髓涂片可见苯组小鼠骨髓细胞形态及增生异常、原始细胞比例明显增加;此外,苯暴露还可引起小鼠LSK细胞比例下降,造血干祖细胞向GEMM和GM分化能力降低。以上结果表明苯暴露可引起小鼠外周血细胞计数降低、骨髓和脾脏造血抑制,骨髓细胞形态和增生分化异常;引起LSK细胞比例下降,GEMM和GM造血集落形成能力降低。第二章基于LC-MS研究苯暴露小鼠的代谢特征使用LC/MS技术,研究苯暴露小鼠体循环(尿液、血浆)及靶器官(骨髓细胞)代谢特征,比较特异性内源性小分子代谢产物及其涉及的代谢通路;结合血液毒性评价及代谢特征,筛选潜在的尿液和血浆中标志血液系统早期损伤的代谢标志物以及与苯造血毒作用相关的特异性代谢通路;此外,比较获得在动物模型骨髓细胞和血浆样品中发现的共同差异代谢产物,在苯暴露人群血浆样本中进行验证。成功建立基于LC-MS的小鼠尿液、血浆和骨髓细胞代谢组学分析平台,结果显示苯暴露扰乱尿液嘌呤、脂肪酸、色氨酸、谷酰基苯丙氨酸和亚精胺代谢通路,干扰血浆色氨酸、组氨酸代谢、γ-谷氨酰循环、脂肪酸氧化以及脂肪酸代谢通路,导致骨髓细胞酪氨酸和苯丙氨酸代谢、赖氨酸分解、肉碱合成以及脂肪酸氧化代谢通路紊乱;比较苯暴露小鼠血浆和骨髓细胞中的差异性代谢通路,发现脂肪酸β氧化通路中的代谢分子均检测到一致的改变,在收集的正常人群、苯暴露对照人群及苯暴露血象异常人群血浆样本中进行验证,发现苯暴露组人群血浆中左旋肉碱含量显著下降,而乙酰左旋肉碱未发生明显变化。以上结果提示苯暴露可干扰小鼠尿液、血浆和骨髓细胞中不同的代谢通路,其中,脂肪酸β氧化代谢通路是在外周样本血浆及靶器官骨髓中的共同差异代谢通路,可能与苯造血毒性效应密切相关。第三章苯暴露对脂肪酸氧化代谢通路的影响及机制研究将C3H/He小鼠暴露于0、20、40、80、160mg/kg·bw苯,以皮下注射方式染毒,每天1次,连续5天,共染毒4周,检测苯暴露对小鼠骨髓细胞脂肪酸代谢通路关键酶mRNA水平和蛋白水平的影响,同时检测对线粒体功能和氧化应激的影响。结果显示,苯暴露可影响脂肪酸氧化通路中肉碱穿梭酶和β氧化关键酶mRNA表达,蛋白水平的验证表明苯暴露可增强小鼠骨髓细胞肉碱穿梭蛋白Cpt1a和Crat的表达,使脂肪酸β氧化通路中Acaa2、A1dh112、Acadv1、Crot、Echs1和Hadha蛋白表达增加;苯暴露引起小鼠骨髓细胞中左旋肉碱、ATP和线粒体膜电位水平降低,同时还可引起H2O2、MDA和ROS等氧化损伤指标水平增高。以上结果提示苯暴露可影响脂肪酸氧化通路中肉碱穿梭及β氧化过程,引起线粒体功能障碍和氧化应激。第四章乙酰左旋肉碱干预对苯所致造血毒性的影响使用100 mg/kg·bw和200 mg/kg·bw左旋乙酰肉碱干预150 mg/kg·bw苯暴露小鼠,观察乙酰左旋肉碱对苯所致造血毒性、线粒体功能障碍和氧化应激的影响。结果显示,左旋乙酰肉碱对苯暴露导致的小鼠外周血细胞减少无明显作用,但是200 mg/kg·bw左旋乙酰肉碱干预可以明显增加苯暴露组小鼠全骨髓细胞数量、LSK造血干细胞比例和Lini-C-kit-Sca-1+造血祖细胞比例;乙酰左旋肉碱干预可以在一定程度上减轻苯所致的线粒体损伤,可降低苯暴露所致H202、MDA和ROS增加;200 mg/kg乙酰左旋肉碱干预可明显降低苯暴露小鼠骨髓细胞尾部DNA含量、尾距和尾长,减轻DNA损伤。以上结果提示乙酰左旋肉碱干预可在一定程度上减轻苯所致小鼠全骨髓细胞、LSK造血干细胞损伤,其作用机制可能涉及减少苯暴露所致氧化应激,降低苯诱导DNA损伤。第五章MDS-Evi1基因与苯毒性关系初探及其参与骨髓造血干细胞凋亡调控的研究使用0、1μm、5μm和10μm1,4-苯醌染毒小鼠骨髓lin-细胞24小时,检测细胞增殖、细胞凋亡以及MECOM基因表达,同时在苯暴露小鼠骨髓细胞中检测MECOM蛋白的表达;随后建立在ME表达细胞中特异性敲除Bax和Bak基因的MEm2小鼠,观察LSK细胞数量、细胞增殖、细胞凋亡、集落形成能力以及竞争性骨髓移植后LT-HSCs的重建能力。结果显示,5μm和1Oμm1,4-苯醌组细胞存活率明显下降,1μM 1,4-苯醌组细胞的凋亡率最大;随着染毒剂量的增加,细胞MECOM基因表达增加;体内实验结果显示160 mg/kg·bw苯暴露引起MECOM蛋白表达显著增加。ME基因敲除小鼠LSK细胞的数量下降,增殖加速,凋亡率增加,且这种凋亡是造血干细胞自发性的;在ME表达细胞中特异性地敲除Bax和Bak基因可使LSK细胞数量和增殖正常,骨髓细胞CFU-GEMM和CFU-GM集落形成能力增加,可以挽救MEm2/m2小鼠LT-HSCs重建能力。以上结果提示苯暴露可增加癌基因MDS-Evi1表达水平,该基因通过Bax和Bak通路参与造血干细胞增殖、凋亡和重建功能调控。总结综上,本研究成功建立苯中毒小鼠模型,结果表明苯暴露抑制造血,同时可扰乱小鼠尿液、血浆和骨髓细胞不同代谢通路,其中,脂肪酸β氧化代谢通路可能与苯造血毒性密切相关;进一步研究表明苯暴露引起脂肪酸氧化通路中肉碱穿梭及β氧化过程中关键酶表达增加、线粒体功能障碍和氧化应激;而给予乙酰左旋肉碱干预可在一定程度上减轻苯所致小鼠造血系统损伤,其作用机制可能涉及减少苯暴露所致氧化应激和DNA损伤;此外,苯暴露可增加癌基因MDS-Evi1表达水平,该基因通过Bax和Bak通路参与造血干细胞增殖、凋亡和重建功能调控。