绵羊痒螨重组巨噬细胞迁移抑制因子诱导兔皮肤嗜酸性粒细胞聚集

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绵羊痒螨(Psoroptes ovis)是寄生于家养和野生动物皮肤表面的一种常见外寄生虫,其具有高度传染性,给养殖业造成严重经济损失,同时危害野生动物的生存。P.ovis引起的皮肤损伤是宿主的主要病变,皮损区呈现以嗜酸性粒细胞(EOS)浸润为主的皮肤炎症反应,且EOS的数量与P.ovis感染严重程度和易感性密切相关,表明EOS的聚集可能对P.ovis致病具有重要作用,但具体哪些P.ovis抗原可促进EOS聚集尚不清楚,有待进一步研究。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)被证实可促进EOS成熟和趋化,利于组织EOS浸润,课题组前期分析发现P.ovis转录组中存在MIF同源基因,故推测P.ovis的MIF可能被虫体分泌至皮损区促进宿主皮肤EOS聚集。因此,本研究拟从离体和在体模型去证实上述推测,为进一步理解P.ovis的致病过程奠定理论基础。一、绵羊痒螨MIF的虫体转录水平与组织定位本研究经生物信息学分析发现绵羊痒螨MIF(PoMIF)含2个α螺旋、6个β折叠和MIF保守结构域,三级结构呈典型的三聚体形式,符合MIF家族结构特征,且Po MIF在NJ树中与宿主MIF处于不同的分支,亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,Po MIF基因在雌螨中的表达量极显著高于雄螨、幼螨和若螨(P<0.01),且其在饥饿虫体中的表达量极显著高于饱食虫体(上调8.9倍)(P<0.01)。免疫荧光定位显示,天然Po MIF蛋白主要分布于雌螨的卵巢和输卵管,其在皮损区分布于表皮的棘层和颗粒层,表明该蛋白可被虫体所分泌。综上,Po MIF是一种排泄分泌蛋白,且其可能参与了P.ovis虫体的生理发育过程。二、rPoMIF对致敏兔PBMC和HaCaT细胞嗜酸性粒细胞浸润相关因子转录水平的影响本研究以致敏兔(allergic rabbits)的外周血单个核细胞(PBMC)和人永生化角质形成细胞(Ha Ca T)为体外模型,CCK8筛选重组Po MIF(r Po MIF)最佳刺激浓度和作用时间,在最佳条件处理后,经荧光定量PCR检测嗜酸性粒细胞浸润相关分子的转录水平。结果显示r Po MIF刺激PBMC和Ha Ca T的最适浓度分别为1μg/m L和100 ng/m L,最适处理时间均为24 h;最佳刺激条件下,r Po MIF可显著上调兔PBMC和Ha Ca T趋化因子CCL5、CCL11的表达水平(P<0.05),同时上调Ha Ca T细胞因子IL-3、IL-4和IL-5的表达,但对IL-13的表达无显著影响。而在PBMC中,r Po MIF仅轻微促进细胞因子IL-4、IL-5和IL-13表达,但无显著影响。综上,r Po MIF可上调兔PBMC和Ha Ca T细胞嗜酸性粒细胞浸润相关基因的表达。三、rPoMIF对兔皮肤嗜酸性粒细胞聚集的影响本研究以P.ovis致敏兔为在体模型,皮内注射rPoMIF,收集各注射点皮肤,观察组织病理学变化及嗜酸性粒细胞计数。结果发现,r Po MIF引起皮肤真皮层毛细血管扩张、出血以及嗜酸性粒细胞聚集,其中嗜酸性粒细胞的数量比PBS和p ET32a空载蛋白注射组高约30倍(P<0.0001)。荧光定量PCR检测发现r Po MIF显著促进皮肤中细胞因子IL-5,趋化因子CCL5和CCL11以及细胞黏附受体P-选择素和ICAM-1的表达,而对IL-4和IL-13无显著影响。用Miles assay评价r Po MIF对血管通透性的影响。结果显示r Po MIF极显著地增强了染料复合物从血管中的渗出,是PBS对照组的3.6倍。上述结果表明r Po MIF皮内注射可促进皮肤中嗜酸性粒细胞聚集。
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