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背景MicroRNAs(miRNA)是一类长约21-25nt的非编码的内源性单链RNA分子,序列在物种间具有高度保守性,其主要通过与靶mRNA的3’非翻译区的碱基形成完全或不完全配对,从而达到直接降解或抑制靶mRNA,进而发挥基因沉默或调控的作用,而这一作用使其广泛参与了细胞的增殖、分化、凋亡及肿瘤的发生等过程,而近来越来越多的研究表明,相关microRNAs,尤其是miR-21有可能在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展过程中也发挥了重要作用。转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)是一类多功能的多肽类生长因子,广泛参与调节细胞生长、分化、细胞外基质合成及机体炎症、免疫等许多方面,同时,随着近年来其在脂蛋白积聚、炎症过程及内膜纤维细胞增生等诸多方面研究的进展,TGF-β在AS形成及发展过程中的多样化作用也已经逐渐形成了共识,而TGFβRⅡ正是其发挥上述各项生物学作用的必需受体。2010年,台湾的陈等人研究发现,在新生儿脐带血单核细胞当中miR-21通过作用其靶基因TGFβRⅡ影响了先天性IgE的产生及变应性鼻炎进展,TGFβRⅡ是miR-21的直接靶基因。目的通过建立高脂饮食诱导的兔AS模型,比较miR-21在AS模型血管及正常血管表达当中的差异,同时分别应用荧光定量PCR及免疫组化技术分析TGFβRⅡ在两组血管当中的表达情况,初步探讨两者在AS发生、发展过程中的作用及关系,为进一步认识AS的发病机制提供新的思路。研究内容和方法一、构建兔AS模型12只3月龄体重在2.0-2.5kg雄性新西兰大白兔随机分为2组:(Ⅰ)正常饲料组(NS组),(Ⅱ)高脂饮食组(2%胆固醇+8%猪油,FS组),从实验最初开始经耳缘静脉抽血测血脂指标(TC,TG,LDL-C,HDL-C),体重,并每隔4周测一次,直至12周时,发现模型组相关血脂水平平均达到正常组的6～10倍,预测模型可能成功,遂取主动脉弓,首先行大体观察内膜是否有浅黄色斑块状突起,其次进行苏丹IV染色以观察内膜脂纹形成情况,最后行HE染色镜下观察泡沫细胞及脂核或脂质池的形成情况;综合以上指标判断兔AS模型是否构建成功。二、主动脉弓microRNA-21、TGFβRⅡ的表达研究高脂饮食诱导的AS动物模型建立成功后,于无菌手术平台分离主动脉弓组织,分别予以液氮保存及石蜡包埋固定;在一月之内,取出液氮保存的主动脉弓,应用荧光定量PCR技术分别检测TGFβRⅡmRNA及miR-21的表达;对于TGFβRⅡ蛋白在血管各层的表达情况则采用免疫组化来检测。三、miR-21与TGFβRⅡ关系的初步探讨对miR21及TGFβRⅡ在血管当中的表达量作相关分析。研究结果一、AS兔模型的评价1.1血脂改变:FS组较NS组大白兔血脂明显增高(TC:33.64±12.36 vs.2.69±2.07,HDL-C:2.64±0.64 vs. 0.83±0.52, LDL-C:27.30±9.46 vs.1.54±1.18,三者均P<0.01,但TG:1.90±1.27 vs. 0.65±0.35,P>0.05);1.2血管AS病理改变:FS组,剖开主动脉弓可见内膜面有淡黄色斑块状隆起,散在或融合成片,以血管分叉处最为明显,其长轴多与主动脉长轴平行;NS组,主动脉内膜平整、光滑,无脂质沉积。1.3苏丹IV染色:FS组,主动脉内膜斑块状隆起处被染成猩红色,整个被染色部分片状分布,红白分明;NS组主动脉内膜光滑,几乎不存在任何红染,呈现内膜本色。1.4 HE染色:FS组,主动脉内膜明显增厚,呈新月状或圆弧状凸起,内弹性膜被破坏,可见大量泡沫细胞形成,胞浆内含有大量脂质空泡,中膜平滑肌增生不规则;NS组,主动脉管壁分层清晰,内膜光滑、完整、无增厚,内皮下无脂质沉积,中膜平滑肌细胞排列规则整齐。该模型各项指标符合动脉粥样硬化的表现,AS模型构建成功。二、主动脉弓microRNA-21、TGFβRⅡ的表达研究2.1 FS组主动脉弓miR-21的表达较NS组明显增高(82.50±54.30 vs.21.01±11.83,P<0.05),提示在AS模型主动脉中存在miR-21的异常高表达。2.2 FS组主动脉弓TGFβRⅡ在mRNA及蛋白水平的表达较NS组都明显增高(mRNA:0.19±0.08 vs.0.09±0.05,P<0.05;蛋白IOD:190.40±102.71 vs. 40.19±26.83,P<0.01),同时免疫组化图片显示NS组可见主动脉血管内、中膜TGFβRⅡ呈散在弱阳性表达,而其在FS组则是内膜表达明显增高,呈强阳性表达,中膜却未见明显增高,提示AS模型中主动脉血管内膜存在TGFβ受体的上调。三、miR-21与TGFβRⅡ关系的初步探讨通过对miR -21和TGFβRⅡmRNA的PCR结果采用Pearson相关分析,发现两者之间存在统计学意义上的相关(r=0.654 P<0.05)。结论1、在高脂饮食诱导的兔动脉粥样硬化模型中,miR-21和TGFβRⅡ可能参与动脉粥样硬化斑块的形成。2、在动脉粥样硬化斑块的形成过程中,血管内膜miR-21和TGFβRⅡ的表达存在相关性。