绵羊分离株单增性李氏杆菌溶血素基因的原核表达及生物学活性分析

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:alwbgs
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
单核细胞增生性李氏杆菌(Listeria monocytogenes, LMO)是李氏杆菌属的重要成员,作为一种重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌在公共卫生学上有重要意义,如何找到一种快速、敏感特异、合理的检测方法,是各国卫生部门目前亟待解决的问题之一。LMO的致病性与多种毒力因子有关,但LMO溶血素O(Listeriolysin O,简称LLO)是该菌侵染力的重要组成成分,也是LMO的主要毒力因子,它存在于所有的致病性LMO中。LLO是一种能结合胆固醇,可被巯基活化的细胞溶解素,由hlyA基因编码。本研究首先采用生化反应、溶血实验、致病力实验等常规方法对从疑似LMO患病羊脑组织分离的病原作了初步鉴定。随后,分析比较GenBanK上登录的李氏杆菌hlyA基因序列,设计特异性引物,应用PCR扩增LMO hlyA基因长度为722bp的高度保守片段,对分离菌进行进一步确诊。在此基础上,建立PCR检测方法,此方法的检测极限为104cfu/mL,并且具有良好的稳定性;用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、链球菌检测该方法的特异性,只有LMO能扩增出目的片断,干扰试验的检测极限仍能达到104cfu/mL。该方法对于检测食品中的LMO具有很好的使用价值。利用PCR技术扩增LMO的hlyA基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序后证明,所克隆的1 594bp的片段含溶血素O蛋白基因1 512bp的完整开放性阅读框,编码504个氨基酸,其核苷酸序列和氨基酸序列与国外发表(F5782)的LLO蛋白基因的同源性为100%。将由重组质粒pMD18-T-hlyA上克隆的不含信号肽序列的目的片断和表达载体pGEX-4T-1分别酶切后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过酶切鉴定及PCR扩增筛选阳性克隆,用IPTG诱导表达,收集菌液进行ELISA检测、SDS-PAGE电泳、Western-blot分析,结果表明,hlyA基因在大肠杆菌中成功表达,其表达产物(GST-LLO)为分子量86KD的融合蛋白,并能被LMO阳性血清所识别,以此为包被抗原的间接ELISA可以将LMO阴、阳性血清区分开;猪红细胞溶血实验证明融合蛋白具有较强的裂解真核细胞膜的作用,一定剂量的腹腔注射能将小鼠致死,表明表达产物GST-LLO具有生物活性。这为进一步单抗研制和疫苗设计、研究其致病与免疫机理、建立间接ELISA诊断方法提供了条件。
其他文献
高中学生的学习任务繁重,面临高考,课业负担困扰着他们.新课程改革要面临最大的一个问题就是如何使课堂教学效率最大化,有效教学是一条重要途径.高中化学教学的“有效”,更强
新课标提倡培养学生自主学习的能力、探究能力,是社会发展的需要.本文通过收集数学教学上关于兴趣培养、培养学生的自主探究能力的研究资料以及根据自身的教学经验、反思.从
近年来,我省小型铁矿选厂发展较快,已建成投产不同规模的小铁选矿厂百余座,其规模从年处理原矿石几万吨到十几万吨有的达几十万吨。这些选矿厂工艺简单、投资少、建厂快、效
<正> 在我国新闻报道领域中,通讯员作为一个整体角色具有重要的地位和作用,通讯员作为一个数量极大的客观存在力量,对我国无产阶级新闻事业的发展有着深远影响。在激烈的新闻竞争中,通讯员的力量是不可忽视的。
新课标是国家目前最新颁布的基本纲领性教育文件,它标志着我国基础教育改革的新阶段,是国家对教育课程规范及质量的基本要求.小学语文是学生在任何学习阶段阅读写作、理解创
马巴贝斯虫是一种血液寄生虫,马属动物感染该寄生虫后,可引起一种血液原虫病,通常把它叫作马巴贝斯虫病。由于马巴贝斯虫危害大,难以根治,对国际马匹贸易产生很大影响,因此各国都将
为探讨复方当归散对慢性氟中毒大鼠的防治作用及其抗氟机理,本实验采用Wistar大鼠自由饮用一定量含氟自来水的方法,人工复制慢性氟中毒模型,同时经口灌服不同剂量的复方当归
可持续发展是科学发展观的一个基本要求,其主要强调了人与自然的协调发展.在现代化素质教学过程中,本文从区域性可持续发展角度出发,给学生从小树立一个正确对待环境、资源与
目的:探讨胃肠间质瘤(gastrointestinal stomal tumors,GIST)患者肿瘤组织中c-Kit和PDGFRA基因各亚型突变情况的研究。方法:应用直接测序方法检测65例GIST石蜡组织中c-Kit基
以吉林建筑大学为例,通过数据分析和走访学校后勤部门方法,考察了该校垃圾分类的处理方式,为吉林建筑大学制定了垃圾分类的处理方案.结果表明:校园垃圾进行合理的分类,可以实