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兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、高传染性和致死性兔病,该病主要以呼吸系统出血、实质器官淤血水肿、肝脏坏死、淤血及出血性变化为主要特征,严重危害着世界养兔业的发展。RHDV为单股正链RNA病毒,基因组全长约7.5kb。目前RHDV在体外尚无稳定分离培养的细胞系,严重影响着RHDV的细胞侵染机理和防控等方面的研究。为探索RHDV侵染机制,本研究通过酶消化法对乳兔脾脏原代细胞进行了分离培养与建系,并进行建系细胞的RHDV初步感染试验,具体内容如下:1、培养乳兔原代细胞的过程中,从脾脏组织中分离出一株成纤维型形态的细胞,命名为RS-17,通过对细胞传代培养条件优化、细胞标志性蛋白检测、细胞生长曲线、细胞核型以及细胞致瘤性等进行测定,以对细胞的生长特性以及生物学特性进行研究。结果显示RS-17细胞具有血清依懒性、成纤维细胞标志性蛋白检测阳性、具有正常的核型、无致瘤性,且目前细胞传至95代仍可稳定生长。这为RHDV感染机制相关研究提供了细胞材料。2、根据RHDV的基因结构,本文拟设计七对引物对本实验室保存的RHDV SCH04株进行全基因测序,并参照NCBI已登录的32株RHDV病毒VP60基因序列,ORF2基因序列以及全基因序列对其进行遗传进化分析以及比较,结果SCH04基因组全长7439 bp、与32株参考毒株全基因的核苷酸同源性为78.3%~99.8%;与VP60基因序列核苷酸同源性79.1%以上,ORF2编码基因序列核苷酸与32株参考毒株核苷酸同源性为84.2%~99.2%,进化树显示SCH04属于抗原变异株RHDVa(GI.1a)基因群。SCH04株全基因序列的测定与分析不仅丰富了RHDV的流行病学材料;而且为感染试验提供了可靠的RHDV背景资料。3、用RHDV SCH04毒株分别进行家兔原代肾脏细胞感染、RS-17感染、以及SCH04株RNA在RS-17细胞转染研究,感染后观察细胞的CPE并收取细胞利用Taq-Man实时荧光定量RT-PCR的检测方法进行检测。结果显示SCH04株在感染肾脏原代细胞后出现轻微CPE,荧光定量检测细胞内病毒核酸含量阳性;RS-17细胞在首次感染时细胞出现CPE,但是随着继续盲传,细胞CPE减弱,荧光定量检测病毒核酸含量随着传代次数增多而减少,传第4次后细胞病毒核酸检测阴性;RNA转染RS-17细胞后,随着时间延长,细胞皱缩变多,CPE明显,荧光定量检测细胞病毒核酸含量阳性,为进一步RHDV细胞侵染机制研究提供了科学参考。