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神经胶质瘤是一种最常见的颅内肿瘤，在脑部的胶质瘤中最为严重的就是恶性神经胶质瘤，WHO定为四级。它在脑组织中具有很高的浸润性和严重的破坏性。统计资料表明其发病率占全部颅内肿瘤的40％，我国每年新查出此病患者约10万人，美国每年新查出的24000个病例中，2／3左右的人在当年死亡，目前此病尚无有效的治疗方法。因此，寻找可能的致癌信号通道，鉴定其新的靶基因，搞清其调控机制对于恶性神经胶质瘤的治疗与诊断有着十分重要的意义。 既往研究揭示，细胞周期是在一系列正负调控因子相互构成的复杂网络作用下进行的，由细胞内外多种因子参与的十分复杂而微妙的过程。细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关，参与细胞周期调控的主要分子有细胞周期蛋白(Cyclins)，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs)。细胞周期异常与肿瘤的关系已成为当今研究的热点。 最近，香港大学分子生物研究所通过差异显示技术鉴定出一个新基第四军医大学们阵d七研究』匕学位勺仑j忆因，它在患有恶性神经胶质瘤的病人组织标本中过度表达，在低级神经胶质瘤中低表达或者不表达，生物信息学分析表明，这个基因是新的细胞周期相关激酶(Cell cycle relatedki画ase，CCRK)，它的功能未知。该所研究人员分析了19例患有恶性神经胶质瘤(W)的香港病人组织标本并与正常的大脑组织样本做了比较，发现有17例升高(89%):然而，在7例低级神经胶质瘤样本中，CCRK基因表达水平正常。同时对6例人的多种级别神经胶质瘤细胞系进行检查时，发现CCRK基因在5例样本中高水平表达，1个细胞系低水平表达，但这个细胞系也是唯一显示低细胞增殖率并且在裸鼠不能产生肿瘤的细胞系。这些结果说明CCRK基因与低级神经胶质瘤发展成恶性神经胶质瘤，并且与增加细胞增殖率和肿瘤发生有关系。我们将研究CCRK基因在人的恶性神经胶质瘤和纤维原细胞系中潜在的肿瘤发生功能。本课题的研究目的是在该所发现CCRK基因的基础上，分析人的CCRK基因的启动子和与之有关的转录调控因子。为深入研究CCRK基因及相关调控机制，寻找新的治疗药物或作用靶点打下基础。 本研究通过巢式PCR方法，从人的基因组总DNA分离出CCRK基因5’非编码区大小为IO72bP的片段。这段片段的3’端起始点在第一个外显子里第一个翻译密码子ATG(+l)上游128 bp处。以1072饰为模板，对启动子进行5’端删除分析，分别扩增出95lbPC1079/一128)，564bP(·692人1 28)，3 1 3bP介441八1 28)，1 1 lbPC239/一128)的片段，为了便与PGL3一Basic荧光素酶报告载体重组构建，人工加上克隆位点，5’端带有KPnl，3’端带有X五。I位点。瞬时转染恶性神经胶质瘤细胞系U373，通过D耐一luciferase分析，564饰片段有最强的活性，313片段为有活性的最小片段，也是核心启动子的上游位点。在鉴定人的CCRK基因的转录起始点时，采用5’.RACE技术，得到的PCR产物直接测序，定位一242“T’’为转录起始点。通过启动子3’端小片段删除分析，249bP〔367/一128)，194bP(一322八128)，144bPC272/- 128)均无活性，因此3’端249个核昔酸不存在核心启动子序列，据此，我们定位一段74bP的区域为核心启动子C441八367)。通过生物软件分析，发现在这段核心启动子区域内有三个很重要的结合位点，Delta EF一1，NF一虑和SPI。我们决定对这三个结合位点的核心序列进行定点突变，突变后瞬时转染U373，经Dual一luciferase萦四军医大学协士布开，七月匕月卜位今仑j忆assay分析发现Delta EF一1的活性明显升高，NF一kB没有变化，SPI的活性降低但不太明显，但在BT-325里Delta EF一1的活性没有变化，NF一虑活性下降，sPI的活性明显升高。我们进一步通过电泳迁移率但MSA)实验鉴定，Delta EF一1和NF一沼能与U373核蛋白形成特异性的DNA一Protein复合体，由此推测Delta EF一1和NF一虑两个转录因子与人的CCRK基因表达相关。 人CCRK基因启动子的特性研究，为今后研究该基因的转录调控机制打下了基础，将为揭示恶性神经胶质瘤的发生机制及防治措施的研究提供新的思路。