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目的:疟疾是以按蚊为传播媒介的传染病,可以引起严重的并发症甚至死亡。仅2016年全世界就有2.16亿疟疾新增病例和44.5万例死亡病例的报道。尽管通过扩大性干预措施,包括以青蒿素为基础的联合疗法（ACTs）,蚊帐和杀虫剂的使用等多种手段的联合应用使得疟疾的患病率和死亡率大幅度下降。但耐青蒿素恶性疟原虫在东南亚的出现及迅速传播、按蚊抗药能力的增强及疫苗的缺乏,对疟疾的治疗和防控构成了巨大威胁。针对疟原虫的生活史所研制的抗疟疾疫苗主要分三大类:红前期疫苗与红内期疫苗以及传播阻断疫苗（Transmission Blocking Vaccines,TBVs）。红前期与红内期疫苗能有效地降低疟疾的感染率与临床中发病率,但它们的候选抗原都暴露在宿主的免疫环境之下,受宿主免疫压力等诸多因素影响,所以其前景并不如预期乐观。TBVs的抗原主要表达于疟原虫的有性阶段,这类抗原并不在宿主免疫系统的选择压力之下,所以表现出非常低的多态性水平,不易出现抗原的变异,更有利于稳定疫苗的免疫效果,因而成为当前疟疾疫苗研究的热点。值得注意的是,TBVs并不能保护疫苗接种者免于感染疟疾,但是有助于预防疾病的传播。TBVs已经被证明是有效的减少疟疾传播的方法。但迄今为止仅有少量的TBVs候选抗原的功能被证实。人们迫切需要开发出安全高效的新型抗原。经过我们前期的研究发现,伯氏疟原虫有性阶段抗原PSOP25（PBANKA111920）,PbQSOX（PBANKA145540）,PSOP26（PBANKA145770）是高度保守的疟原虫蛋白。PSOP25和PSOP26和pbQSOX是表达于疟原虫动合子阶段的特定蛋白,三者均具有一定的传播阻断效应。我们通过对其进行生物学分析,适当截取优势片段表达重组蛋白,观察新的截短蛋白能否保留原有的生物学功能。以期为进一步研制TBV复合疫苗提供实验依据,奠定基础。研究方法1.三种候选抗原的选择及其生物信息学分析选取疟原虫数据库plasmoDB中功能未知的基因,基因号分别为PBANKA111 920（PSOP25）,PBANKA145540（pbQSOX）,PBANKA145770（PSOP26）,应用相关生物信息学软件进行分析,排除信号肽等低复杂区域,选取抗原决定簇较高,能够分泌到细胞外且具有高度同源性的功能域为目的基因,以便更高效合成蛋白。2.获取目的基因及构建原核表达载体小鼠感染疟原虫后当疟疾血症达到50%时,麻醉后心脏采血采集小鼠血液,提取疟原虫基因组DNA。以此为模板进行PCR,分别扩增三段目的基因。验证正确后克隆入原核表达载体pET32a（+）中,酶切及测序验证。3.重组蛋白的表达与纯化将测序正确的原核表达载体转化到大肠杆菌RGB中增菌,加入IPTG诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测蛋白表达的情况,验证正确后大量表达收集,纯化。采用BCA的方法检测蛋白浓度。4.实验动物免疫及血清采集6-8周雌性BALB/c小鼠28只,随机分为PSOP25组,pbQSOX组,PSOP26组和PBS对照组（n=7）。分别免疫三组重组蛋白和PBS。每两周免疫一次,共免疫三次,于每次免疫前一天与最后一次免疫后第10天收集每只小鼠血液,室温凝集后收集血清。5.重组蛋白的免疫活性检测采用ELISA方法,分别以三种重组蛋白为抗原包被96孔板,1:3200稀释免疫血清作为一抗,1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗,检测抗体效价。6重组蛋白的抗原性测定将纯化的裂殖体,配子体,动合子抗原经疟原虫裂解液处理后用SDS-PAGE电泳分离,转膜。以重组蛋白免疫的小鼠血清（1:500稀释）为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000）为二抗,结合并显色后在荧光图像分析系统中检测。7重组蛋白的传播阻断效应评价给正常BALB/c小鼠腹腔注射1x106 P.berghei pRBC,3天后收集小鼠血液,离心弃去血清。将三组重组蛋白的免疫血清及PBS对照组的免疫血清与动合子培养液按1:10稀释成新培养液,体外培养动合子,显微镜下计数各组动合子的形成数量,计算出阻断动合子形成的效率,以此评估各候选抗原的传播阻断效应。8统计学分析数据以均数±标准差（X±SD）来表示,采用SPSS 17.0软件来处理,检验标准是采用独立样本的t检验。结果1.三种候选抗原的选择及其生物信息学分析经过比对,三组候选抗原与恶性疟和间日疟都具有同源基因。最终选定PSOP25的108-196aa;pbQSOX的268-376aa;PSOP26的189-305aa为目的片段。2.获取目的基因及构建原核表达载体PCR扩增目的基因后将其插入到原核表达载体中,经筛选、酶切、测序正确,表明表达载体构建成功。3.重组蛋白的表达与纯化成功构建的原核表达载体经IPTG诱导后,可见大量可溶性蛋白的表达。使用Ni-NTA柱纯化后对其进行洗脱及透析,所得产物用SDS-PAGE来检测,可清晰看到目标蛋白条带。4.重组蛋白的滴度检测ELISA结果显示,在三次免疫之后小鼠血清特异性抗体滴度显著提高。实验组血清IgG水平在第一次免疫后14天升高（P<0.05）;第三次免疫后10天明显高于对照组（P<0.01）。5.重组蛋白的抗原性检测Western blot显示,抗rPSOP25,抗rPSOP26在动合子处出现明显条带,抗rpbQSOX在动合子处有清晰条带,在配子体处有淡淡的条带。说明三种重组蛋白的抗血清都可以与天然的疟原虫抗原结合,三个重组蛋白都具有免疫原性。6.候选抗原的传播阻断效应评价实验组血清与PBS对照组相比动合子形成率明显受到抑制。其中PSOP25重组蛋白免疫血清动合子抑制率为68.2%,pbQSOX重组蛋白免疫血清动合子抑制率为55.4%,PSOP26重组蛋白免疫血清动合子抑制率为58.9%,p<0.05,差异具有显著差异。说明三组免疫血清均可以阻止部分动合子的形成。结论:1、成功构建了三组截短候选抗原的原核表达载体,成功诱导并提纯出相应的重组蛋白。2、所获重组蛋白具有较强的免疫原性和抗原性。3截短重组蛋白诱导较高的的传播阻断效应,可作为传播阻断候选抗原。