中枢神经系统有限的再生能力使得包括脊髓损伤在内的中枢神经疾病成为临床难以克服的病症。然而,随着科学技术的进步和发展,在神经科学领域,细胞培养、基因技术、生物材料等方面的研究为脊髓损伤提供新的解决方案,特别是细胞移植治疗脊髓损伤成为新的研究热点。新的机遇总是伴随着新的问题和挑战,移植细胞的来源、存活、功能发挥及预后等成为亟待解决的难题。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其具有较强的增殖能力和多向分化潜能,取材方便,来源充足,免疫原性弱,便于自体移植等优点,是一种在脊髓损伤治疗中研究最为广泛的非神经类细胞。虽然移植的MSCs能够参与神经系统在细胞和组织水平上的重建,但由于只有少量的MSCs迁移至损伤部位,因而改善神经功能的作用十分有限。因此,增强MSCs的迁移能力是其更有效用于临床治疗的关键。研究表明,不同组织来源、处于不同细胞周期阶段及不同分化状态的MSCs具有不同的迁移能力,对趋化因子的应答也存在差异。因此,我们通过体外诱导MSCs成神经分化,将分化过程分为五个不同状态,以获得趋化性迁移能力强的MSCs用于细胞移植治疗。有文献报道,损伤区域能释放大量趋化因子诱导细胞的定向迁移,脊髓损伤也是如此。与之相符,在适合细胞移植治疗脊髓损伤的窗口期(7天～14天),我们通过qRT-PCR检测到损伤区域组织中基质细胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)持续高表达。与此同时,我们通过鞘内注射细胞的方法在脊髓损伤7天后移植GFP标记的MSCs,发现细胞多数聚集在损伤区域周围,进一步说明损伤区域存在大量趋化因子诱导细胞的迁移。因此,我们分别研究了 SDF-1α和HGF诱导不同成神经分化MSCs的趋化性迁移的分子机制。MSCs对许多生长因子和细胞因子有趋化性应答,其中SDF-1α和HGF备受关注。SDF-1α 通过其同源受体 CXCR4(C-X-Cchemokine receptor type 4)激活下游信号,在MSCs的迁移和存活中起着关键作用,并刺激移植的MSCs向损伤组织归巢。首先,通过Dunn chamber实验发现,SDF-1α刺激后,MSCs的迁移速率和迁移效率显著增加,与其它分化状态相比,预诱导24 h的MSCs向SDF-1α的趋化能力最强。细胞迁移是一个复杂而精密的过程,伴随着粘着斑(Focal adhesion,FA)的不断合成和解聚以及微丝骨架的不断重排。在迁移的细胞中,粘着斑相关蛋白FAK和paxillin的酪氨酸磷酸化水平都有增加,并且FA信号在SDF-1α诱导的细胞迁移中起重要作用。因此,我们检测了 SDF-1α刺激下的不同分化状态MSCs中FA的合成、周转以及微丝骨架F-actin的聚合,发现预诱导24 h的MSCs中FA的合成、细小FA的比例以及FA的周转增加最显著,且F-actin的聚合最明显,与这群细胞向SDF-1α最有效的迁移能力相一致。同时,SDF-1α处理MSCs,FAK和paxillin的磷酸化变化也与MSCs的分化状态相关。另外,我们发现P13K/Akt信号通路涉及所有分化状态MSCs中SDF-1α诱导的FA的合成和周转,而MAPKs(包括ERK1/2,p38MAPK和SAPK/JNK)信号通路的影响随MSCs的分化状态而定HGF同样能促进包括MSCs在内多种细胞的迁移、扩散和增殖。我们同时研究HGF对不同分化状态MSCs趋化性迁移的分子机制。越来越多的证据表明激活β-catenin信号能促进MSCs的迁移,β-catenin信号通路激活是指β-catenin蛋白从降解复合体中游离,在胞质中累积进一步入核,与TCF/LEF转录因子相互作用,促进靶基因的转录从而调节细胞的行为。我们发现HGF处理MSCs后,β-catenin入核、活化形式的β-catenin、TCF/LEF的转录活性以及β-catenin信号下游经典靶基因c-Myc的表达均显著增加,说明在MSCs中,HGF能激活β-catenin信号通路。同时,不同分化状态MSCs中β-catenin信号的激活及改变β-catenin信号后对HGF的趋化性响应也不同,其中预诱导24h的MSCs应答最显著。据报道,Nedd9(neuralβrecursor cell exβressed,develoβmentally down-regulated 9)是 β-catenin 信号通路下游靶基因,且参与细胞极化及极化方向的稳定、FA的周转和细胞的定向迁移。我们在MSCs细胞中也发现激活β-catenin信号通路促进Nedd9的表达,抑制则Nedd9表达减少。为了进一步阐明HGF诱导MSCs趋化性迁移的分子机制,我们通过慢病毒干扰β-catenin及其下游与迁移相关靶基因Nedd9,Boyden chamber检测发现干扰β-catenin及Nedd9均抑制HGF诱导的趋化性迁移,表明HGF诱导MSCs的趋化性迁移可能通过激活β-catenin信号后上调靶基因Nedd9表达实现的。进一步研究发现,Nedd9通过调节粘着斑的合成调控MSCs趋化性迁移。综上所述,在MSCs成神经分化过程中,预诱导24h的细胞向SDF-1α和HGF趋化性迁移能力最强,是用于细胞移植治疗的理想对象。在研究Nedd9调控MSCs向HGF趋化性迁移的过程中,长时间高表达Nedd9的MSCs形态会发生改变,像神经元样细胞伸出长长的突起,预示Nedd9可能参与神经分化过程。Nedd9在神经前体细胞中特异性高表达,随着分化被下调,由于星形胶质细胞与神经元都由神经前体细胞分化而来,因此,我们猜测Nedd9能诱导星形胶质细胞经由神经干细胞再向神经元的转分化。我们通过慢病毒介导可诱导Nedd9表达的四环素诱导Tet-on系统,采用Dox诱导星形胶质细胞先高表达Nedd9,细胞去分化形成神经干细胞,再降低表达使形成的神经干细胞在无血清培养基中分化为神经元,证实了我们的猜想。在此过程中,神经转录因子Isl1、Mytl1、Olig2及Prox1的表达增加。除此之外,我们还发现高表达Nedd9促进星形胶质细胞的增殖和存活,这将有利于获得大量用于移植的细胞及移植后细胞的存活。最后,我们通过大鼠脊髓T9～T10横断的损伤模型对以上体外实验进行体内验证。BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)评分(评判大鼠后肢运动能力)及组织免疫荧光染色实验表明,移植预诱导24 h的MSCs与移植未分化MSCs相比细胞向损伤区域迁移数目增多,脊髓损伤空洞减小,BBB评分增加;移植星形胶质细胞衍生的神经干细胞在受损脊髓中分化为脊髓特异神经元以及促进后肢运动能力恢复。本实验通过探讨促进MSCs趋化性迁移和诱导星形胶质细胞转分化的分子机制来为细胞移植修复脊髓损伤提供新思路,为今后临床应用治疗脊髓损伤提供理论基础。