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目的和意义本研究旨在通过观察中药制剂淫羊藿素（icaritin,Ict）对食管癌干细胞（cancer stem cells,CSCs）的增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响来探讨不同浓度淫羊藿素对食管癌干细胞生理活性的作用,并探讨了淫羊藿素对Wnt和Hedgehog信号通路相关蛋白表达的影响机制及作用机理,提供理论依据和食管癌的潜在治疗的新思路。研究方法一、细胞分选和培养:将细胞在含有10%FBS在37℃下,5%CO2,饱和湿度的RPMI-1640的完整培养基中培养。取细胞进行培养对数生长期。培养基每3天更换隔日和传代。干细胞通过流式细胞术分选来筛选CD133（肿瘤干细胞标记物）阳性细胞。二、淫羊藿素对肿瘤干细胞增殖的影响（CCK8测定）:取对数生长期的CD133阳性细胞,计数前采用0.25%胰蛋白酶消化,制备单细胞悬液。将10,000个CD133阳性细胞接种至96孔培养板各孔中,随后置于含淫羊藿素（浓度分别为0、12.5、25、50和100μmol/L）的培养基中培养,各浓度设置3个复孔。培养24、48、72和96小时后,应用10μL CCK8在37℃下孵育2h,测定吸光度。三、淫羊藿素对肿瘤干细胞迁移的影响（Transwell法）:将BSA-RPMI 1640（0.1%）添加至24孔板各孔中,将Transwell各小室置于培养板上。随后,加入不同浓度（0、12.5、25、50和100μmol/L）淫羊藿素处理的100μL细胞悬液。孵育12h后取出小室,甲醛固定。对细胞进行苏木精-伊红染色。弃滤膜内细胞,中性树脂封闭滤膜。对穿透滤膜的细胞进行计数。随机选取5个视野中的细胞进行计数,每组重复3次。四、淫羊藿素对肿瘤干细胞侵袭的影响（Transwell法）:将BSA-RPMI 1640（0.1%）添加至24孔板各孔中,将Transwell各小室置于培养板上。随后,加入不同浓度（0、12.5、25、50和100μmol/L）的淫羊藿素处理的100μL细胞悬液。孵育12h后取出小室,甲醛固定。对细胞进行苏木精-伊红染色。弃滤膜内细胞,中性树脂封闭滤膜。滤膜内表面涂敷5μg基质,制备人工重组基底膜。对穿透滤膜的细胞进行计数。随机选取5个视野中的细胞进行计数,每组重复3次。五、淫羊藿素对肿瘤干细胞凋亡的影响（流式细胞术）:以干细胞为对数生长期制备的单细胞悬液接种于密度为2×105/孔的12孔板中。接种24h后加入不同浓度（0、12.5、25、50和100μmol/L）的淫羊藿素,培养24h后收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。六、淫羊藿对Hedgehog和Wnt信号通路相关蛋白表达的影响（Western blotting）应用RIPA缓冲液提取不同浓度淫羊藿素培养24h后细胞蛋白质。将蛋白质裂解物与SDS样品上样缓冲液以1:4的比例混合,煮沸,变性,并通过1%SDS-PAGE分离。随后,将蛋白质转移至PVDF膜,并在室温下用含有5%脱脂奶粉的TBS-T封闭PVDF膜2小时。将PVDF膜与一抗在室温下孵育2小时,然后在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2小时。在黑暗中加入ECL试剂,随后进行X光片曝光、开发和修复。使用ImageQuant350电泳凝胶成像分析系统进行图像处理。研究成果（1）淫羊藿素抑制肿瘤干细胞增殖的结果:采用CCK8法观察不同浓度（0、12.5、25、50和100μmol/L）淫羊藿素对干细胞增殖的抑制作用。结果表明,淫羊藿素可显著抑制干细胞的体外增殖,且随淫羊藿素浓度的增加,细胞存活率呈下降趋势。（2）淫羊藿素抑制肿瘤干细胞迁移和侵袭的结果:采用Transwell法观察不同浓度淫羊藿素（0、12.5、25、50和100μmol/L）对干细胞迁移和侵袭的抑制作用。结果表明,淫羊藿素可显著抑制干细胞的迁移和侵袭能力,且该抑制作用随淫羊藿素浓度的增加而增强。（3）淫羊藿素抑制肿瘤干细胞凋亡的结果:采用流式细胞术观察不同浓度淫羊藿素（0、12.5、25、50和100μmol/L）对干细胞凋亡的影响。结果表明,淫羊藿素可显著诱导干细胞凋亡,且该作用随淫羊藿素浓度的增加而增强。（4）淫羊藿素影响Hedgehog及Wnt信号通路相关蛋白的表达情况:采用蛋白印迹法检测CSCs提取并淫羊藿素处理（50μmol/L）后肿瘤干细胞中相关蛋白的表达。结果表明,淫羊藿素可下调Hedgehog通路中Hedgehog、Smo和Gli的水平,上调Wnt信号通路中GSK3β,并下调Wnt和β-catenin水平。结论及意义本实验结果表明,淫羊藿素可抑制食管癌细胞的生理活性。不同浓度的淫羊藿素处理可抑制食管CSCs的增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡。此外,淫羊藿素还可下调Hedgehog通路中Hedgehog、Smo和Gli的水平,上调Wnt信号通路中GSK3β,并下调Wnt和β-catenin水平。综上所述,淫羊藿素是可以作为一种极具有研发前景的药物在食管癌的治疗中发挥作用。